小麦酯酶的提取及反应条件的研究

魏燕超，翁 霞，王新雨

( 1.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710000;2.鞍山师范学院 化学与生命科学学院,辽宁 鞍山 114007; 3.鞍山市第八中学,辽宁 鞍山 114031)

在农业生产中，农药除病虫、杂草的功效至关重要[1-2]，但由于农药的不合理使用，导致农药残留的现象时有发生[3-4].而具有价格低廉、防治对象多、使用范围广等优点的有机磷农药在农药残留中名列全茅[5-6].陈焕娟检测95份蔬菜样品，有机磷类农药检出率高达21.1%[6]，王保成检测160份蔬菜，有机磷农药检出率为16.25%;其中，24份蔬菜农残含量超标[7].王占成检测222份果蔬发现9类果蔬中农药残留总超标率高达54.5%，而有机磷类农药超标率高达60.81%[8].

现阶段农药残留检测方法主要有色谱法、光谱法和快速检测法.而较好满足市场需求的快速检测法又包括酶抑制法、生物传感器法和免疫法.酶抑制法又因易操作、低成本、测时短等优点受基层检测部门的青睐，同时也被列入国家标准[9].酶抑制法常用的酶主要是来自于动物的胆碱酯酶和来自于植物的植物酯酶，而植物酯酶由于原料来源广、价格低、提取简单、敏感性优于胆碱酯酶而广受欢迎[10].其原理是植物酯酶能分解α-乙酸萘酯产生萘酚,而萘酚与固蓝B盐作用生成紫红色偶氮化合物,从而发生显色反应.有机磷农药能抑制植物酯酶的活性，使得植物酯酶不能催化颜色反应继续发生.即导致不能产生萘酚或产生少量萘酚，反应最终显色浅或不显色.所以可用底物分解后产物的吸光度值A来表示酶的活性和农药的残留量，即吸光度值越大，酶的活性越大，农药残留越少.所以本研究选取最常见的小麦为原材料，确定其提取及反应的最优条件，以期为果蔬农药残留的快速检测提供一定的理论指导.

1 材料与方法

1.1 材料

小麦粉(鞍山某超市售);α-乙酸萘酯(分析纯);固蓝B盐(分析纯)；磷酸氢二钠(分析纯);磷酸二氢纳(分析纯);无水乙醇(分析纯);敌敌畏.

实验所用仪器TU-18紫外可见分光光度计；80-2B低速台式离心机；BRAND移液枪；PL-2002电子天平；PB-10 pH计.

1.2 方法

1.2.1 显色基质的配制 将100 mg α-乙酸萘酯溶于80 mL无水乙醇中作为基液，将125 mg固蓝B盐溶于80 mL蒸馏水中作为显色液，再将基液和显色液按1∶9的比例混合成显色基质液(现配现用).

将敌敌畏配制成1.0 mg/L的溶液，均匀地喷洒于白菜上，静置8 h后，将蔬菜正常冲洗，用于后续试验.

1.2.2 小麦酯酶的提取 分别称取10.00 g小麦粉于锥形瓶中，按料液比(g/mL)1∶4加入蒸馏水搅拌，浸泡24 h，再倒入离心管中以4 000 r/min离心10 min，取上清液即为酶液，于4 ℃下保存.

2 结果与讨论

2.1 最大吸收波长的确定

将2 mL pH=6 磷酸盐缓冲溶液加入试管，再分别移取显色基质液200 μL、酶液100 μL使之充分混合.用pH=6 磷酸盐缓冲溶液为空白对照，在400～600 nm波长范围内进行扫描，实验得出酶促反应的最大吸收波长为520 nm，见图1.以下测定均在该波长下进行.

2.2 单因素结果分析

2.2.1 最适酶促反应时间 在2 mL pH=6 磷酸盐缓冲溶液、酶液100 μL、显色基质液200 μL、显色温度35 °C的条件下，测定在5，10，15，20，25 min时紫红色偶氮化合物的吸光度值，确定出酶促反应的最适显色时间为15 min，见图2.

酶抑制法中抑制时间是检测的关键因素，时间短会使得抑制不充分，导致结果有出入；时间过长不仅会增加检测时间又会使得酶活性下降.如李顺等人研究发现最佳抑制时间分别是12,15,30 min[11-13]，这可能是农药浓度、水浴温度等不同而导致时间有差异.

图1 植物酯酶的最大吸收波长曲线 图2 酶促反应时间曲线

2.2.2 最适酶促反应温度 在2 mL pH=6 磷酸盐缓冲溶液、酶液100 μL、显色基质液200 μL、显色时间15 min的条件下，测定在 25，30，35，40，45 °C的反应温度下紫红色偶氮化合物的吸光度值，确定出酶促反应的最适温度为35 °C，见图3.

姜璐研究发现酯酶的最佳酶活力的水浴温度为40 °C，但纯化后的酯酶在30～40 °C均有较高的稳定性，这与本试验的结果相一致.

2.2.3 最适酶促反应酶液量 在2 mL pH=6磷酸盐缓冲溶液、显色基质液200 μL、显色时间15 min、显色温度35 °C的条件下，测定在50，100，150，200，250 μL的酶液量下紫红色偶氮化合物的吸光度值，确定出酶促反应的最适酶液量为100 μL，见图4.

李顺研究发现酶液量在50～100 μL时,酶抑制率增加最显著,大于100 μL后,酶抑制率变化不显著[11]，这与本研究结果相一致.但本文发现酶液量大于200 μL后吸光度值呈下降趋势，这也可能是由于此时酶液量过多，酶促反应时间相对较短导致.

图3 酶促反应温度曲线 图4 酶促反应酶液量曲线

图5 酶促反应pH值曲线

2.2.4 最适酶促反应pH值 分别取2 mL pH=5.5，pH=6，pH=6.5,pH=7,pH=7.5 磷酸盐缓冲溶液，在酶用量100 μL、显色基质液200 μL、显色时间15 min、显色温度35 °C的条件下，测定紫红色偶氮化合物的吸光度值，确定出酶促反应的最适pH=6.0，见图5.

2.3 正交试验确定酶促反应的最优条件

由表1可以看出，酶液量极差最大，其次分别为显色温度、显色时间、pH.即各因素的主次顺序为D>B>A>C.酶反应条件最优水平组合为A3B2C1D3,经实验证实得，即显色时间为20 min,显色温度为35 °C，pH为5.5，酶液量为150 μL为最佳条件.

由表1可以看出，D因素影响显著性差异，A、B、C无显著性差异.因此，酶液量对酶促反应的影响达到了显著水平，而温度、时间、pH值对酶促反应不显著.

表1 正交试验设计及数据处理

表2 方差分析表

2.4 验证试验

选正交试验中的最佳条件，即显色时间20 min、显色温度35 °C、pH=5.5、酶液量150 μL做验证实验，得出A3B2C1D3组为这9组中的最优组合.即重复测定3次的吸光度值分别为0.671，0.669，0.675，平均值为0.672.

3 结论

本试验选用小麦酯酶，研究了酶抑制法检测有机磷农药残留的反应条件，通过单因素实验和L9(34)正交试验最终确定小麦酯酶酶促反应的最佳条件为显色时间20 min、显色温度35 °C、pH=5.5、酶液量150 μL.