甘肃传统浆水发酵过程中 产双戊烯乳酸菌的分离筛选

蔡苗苗,贠建民,何大星,李芳霞,王永朝

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

浆水是我国西北地区传统蔬菜发酵的酸性调味食品,其气味清香,口味酸醇,含有丰富的益生菌群,营养价值高,夏天可清热解暑,具有开胃止渴、调理脏腑和降血压等功效[1]。研究表明,浆水菜发酵过程中以乳酸发酵为主,其优势菌为乳酸菌(Lactobacillus)[2]。由于乳酸菌不只具有调节人体微生态平衡、降低胆固醇和增强免疫力等重要功能,还可增加食品养分、改善食物风味、调整肠道菌群、清除机体体内有毒物质等诸多保健作用[3-4],其被广泛应用于食品发酵[5],因而乳酸菌菌株的发酵性能将直接影响浆水的风味与品质[2,5]。

近年来,我国对浆水的研究主要集中在微生物的分离鉴定[6-8]、发酵过程中亚硝酸盐的控制[9-10]、发酵工艺[11]以及营养成分的研究[11-12]等方面,而在筛选适合于浆水发酵的优良增香乳酸菌株方面的研究鲜见报道。为此,本试验拟以甘肃天水传统酿制浆水为原料,采用经典的微生物分离方法,筛选高产浆水特征风味物质——双戊烯的乳酸菌,以期为浆水产品实现工业化提供菌株来源,为浆水传统酿制过程中定向调控风味物质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

浆水 甘肃天水孟菇食品生物有限公司；双戊烯标准品 美国Sigma公司;葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖 生化试剂,天津市光复精细化工研究所;吐温-80、NaCl、NaOH、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、KNO3、(NH4)H2SO4、MnSO4·4H2O、MgSO4·7H2O 分析纯,天津市光复精细化工研究所;酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉 生化试剂,北京奥博星生物技术有限公司;CaCO3分析纯,天津市大茂化学试剂厂;石油醚 分析纯,天津市福晨化学试剂厂。

LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;HZQ-X100A恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;PHS-25型数显pH计 上海精密科技仪器厂;SZ51型光学显微镜 日本Olympus公司;JRA-6数显恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司;GC-MS联用仪 美国Agilent scientific公司;U-3010紫外可见分光光度计 Hitachi公司;YXJ-2离心机 湘仪离心机仪器有限公司;FA1204B 型电子天平 上海佑科仪器仪表有限公司;BCD-208BSC冰箱 青岛海尔股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 MRS液体培养基:葡萄糖20 g,酵母膏5 g,蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,乙酸钠5 g,柠檬酸二胺2 g,吐温-80 0.1 mL,MnSO40.28 g,MgSO40.58 g,蒸馏水1000 mL,pH6.2～6.5,121 ℃灭菌20 min[8]。

发酵培养基:葡萄糖20 g,马铃薯50 g,番茄汁70 g,胰蛋白胨15 g,KH2PO410 g,蒸馏水 1000 mL。

1.2.2 浆水的采集 用火焰灼烧后的洁净取样勺，采集浆水样品500 mL,将浆水上清液分别装入10支50 mL无菌离心管中,低温下运回实验室,置于4 ℃低温冰箱中,保存备用。

1.2.3 富集培养 准确吸取1 mL样品,缓慢注入配制好的MRS液体培养基中,于37 ℃恒温培养箱中培养48 h。

1.2.4 乳酸菌的分离纯化 将上述富集好的菌液分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的溶液,再吸取其中稀释度为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌悬液各100 μL，涂布于加入了2% CaCO3的MRS琼脂培养基上,于37 ℃下恒温培养24 h。筛选有透明圈及乳白色、表面光滑的圆形菌落制片,经革兰氏染色和镜检为G+菌的菌株在MRS培养基上反复划线纯化,镜检,直至得到纯菌落[2]。将纯化后的菌株接种于MRS斜面培养基中,继续于37 ℃恒温培养24 h后，保存于4 ℃低温冰箱中。

1.2.5 产双戊烯乳酸菌的初筛

1.2.5.1 双戊烯标准曲线的测定 精确吸取25 μL的双戊烯标准样品,以石油醚为溶剂，定容至25 mL容量瓶中,得1 μL/mL双戊烯标准溶液。取双戊烯标准溶液于1 cm石英比色皿中,同时以石油醚作为参比,用紫外可见分光光度计在200～300 nm波长范围内扫描,绘制出吸光度与波长的关系曲线后,以图像中最大吸光度对应的波长，作为双戊烯标准溶液的最大吸收波长[13]。分别准确移取1 μL/mL的双戊烯标准溶液0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于10 mL的容量瓶中,用石油醚定容至刻度线,并以石油醚为参比,分别在最大吸收波长处测定其吸光度,绘制标准曲线。

1.2.5.2 产双戊烯乳酸菌的初筛 在250 mL的三角瓶中倒入50 mL液体发酵培养基,灭菌后接种上述分离纯化的菌株,于37 ℃条件下恒温培养24 h后活化2代,再按5%(v/v)接种量注入初始发酵培养基中,30 ℃避光培养72 h。发酵结束后,取5 mL发酵液于三角瓶中并加入30 mL石油醚,避光振荡萃取3 h,设置离心机的转速为6000 r/min,离心10 min后[14],取上清液进行紫外检测。将未接入菌种的与发酵培养基同批次灭菌的初始培养基以相同方法培养、萃取和定容,以所得的萃取液为参比液,用紫外可见分光光度计在200～300 nm波长范围内扫描样品,观察215 nm波长处是否有特征吸收峰,实验重复三次[13,15]。根据吸光度值比较发酵液中双戊烯的含量,筛选出产双戊烯水平较高的5株菌进行复筛。

1.2.6 产双戊烯菌株的复筛 配制浓度分别为10、20、30、40、50 mg/L的双戊烯标准溶液。用微量进样器分别准确吸取上述各个浓度的标准溶液5 μL，于气相色谱仪的进样口进样。取经离心过后发酵液的上清液稀释至适当倍数,以环己酮为内标物,石油醚为萃取剂,进行萃取后通过GC-MS分析定量。

在获取作物光谱后，经过光谱异常筛选、光谱变换和光谱定量化计算处理。对不同作物冠层反射率数据进行高光谱特征参数提取、植被指数计算等预处理的基础上进一步分析不同作物参数对比，寻找不同作物识别的敏感参数。

色谱条件:色谱柱(TG-WAX,60 m×0.25 mm×0.25 μm);载气:氦气,流量1.0 mL/min;升温程序:初始温度40 ℃,保持5 min,以4 ℃/min升至100 ℃,保持5 min,再以5 ℃/min升至180 ℃,保留10 min。

质谱条件:接口温度280 ℃,离子源温度230 ℃,离子化方式EI+,电子能量70 eV,扫描质量范围50～450 amu。经计算机在Nist及Wiley标准谱库的检索对比,通过计算机相应的保留指数对比,匹配度大于700(最大值为1000)进行确认[16]。

1.2.7 乳酸菌的初步鉴定

1.2.7.1 菌株产乳酸的鉴定 将分纯菌株接种于MRS液体培养基中，在37 ℃下恒温培养24 h，发酵后,取10 mL发酵液,加入洁净试管中,先滴加1 mL 10%硫酸,再加入1 mL 2%高锰酸钾。取滤纸一条在含氨的硝酸银溶液中浸湿后搭在试管口上,逐渐加热试管至沸腾,使其中的乙醛散发,仔细观察,若试管口的滤纸变黑,则证明该菌株发酵可产生乳酸[17]。

1.2.7.2 形态学鉴定 将以上分纯的菌株接种在MRS琼脂培养基上,于37 ℃恒温培养24 h,观察菌落的颜色和外形特征,并筛选单菌落制片,进行革兰氏染色,在显微镜下观察乳酸菌形态[18]。

1.2.7.3 生理生化鉴定培养基 硝酸盐培养基:葡萄糖20 g,酵母膏0.2 g,KNO37.8 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO41 g,蒸馏水1000 mL,121 ℃灭菌20 min。

硫化氢实验培养基:牛肉膏10 g,蛋白胨10 g,半胱氨酸0.5 g,氯化钠5 g,蒸馏水1000 mL,pH7.0～7.4,121 ℃条件下灭菌20 min。

石蕊牛乳实验培养基:2.5%石蕊水溶液4 mL,脱脂牛奶100 mL,121 ℃下灭菌20 min。

柠檬酸盐实验培养基:柠檬酸钠2.0 g,K2HPO4·3H2O 1.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 5.0 g,(NH4)H2SO41.0 g,溴百里酚蓝1%水溶液10 mL,琼脂12.0 g,蒸馏水990 mL,pH7.0,121 ℃灭菌20 min。

糖发酵基础培养基:蛋白胨20 g,糖(分别以葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖作为碳源)10 g,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1 mL,NaCl 5 g,蒸馏水1000 mL,121 ℃灭菌20 min[19]。

1.2.7.4 生理生化鉴定试验 参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[20]、《伯杰细菌鉴定手册》[21],对高产酸乳酸菌进行硝酸盐试验、过氧化氢酶试验、石蕊牛乳试验、产硫化氢试验、柠檬酸盐试验、pH=9.6和pH=4.6生长试验、糖发酵等试验进行鉴定,具体方法如下:

a.硝酸盐还原试验:将分纯菌株接种于上述硝酸盐液体培养基中,分别于37 ℃恒温培养箱中培养1、3、5 d,各做三个重复,两管不接菌作空白对照。详细实验步骤为:取两支灭菌的空试管，并倒入少量各培养了1、3、5 d的培养液,各加1滴A液(对氨基苯磺酸0.8 g+100 mL 5 mol/L醋酸)与B液(α-奈胺0.5 g+100 mL 5 mol/L醋酸),对照组也加入A液与B液各1滴。之后,溶液若变成玫红色、粉红色、橙色或棕色等表示亚硝酸盐存在,则是硝酸盐还原阳性反应;若无红色出现,再加1～2滴二苯胺试剂,此时若呈现蓝色,则表示培养液中也有硝酸盐,但无亚硝酸盐,表示无硝酸盐还原反应,若未呈现蓝色,表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已被还原成其他物质,故还是硝酸盐还原阳性反应。

b.过氧化氢酶试验:取分纯菌株的菌落于清洁载玻片上,滴加3% H2O2溶液并观察结果,若30 s内产生气泡者则为阳性,反之则为阴性。

c.石蕊牛乳试验:在石蕊牛乳培养基中接种分纯菌株,于37 ℃条件下恒温培养7 d,同时作空白对照,两个重复。7 d后,取出培养物并观测接种菌株的生长变化现象。

d.硫化氢试验:将分纯的菌株接种于上述培养基中,用灭菌镊子取乙酸铅纸条一条垂挂在试管内,纸条下端靠近培养基表面,但不能接触培养基液面,试管上端用塞子塞紧,同时以不接菌的试管做空白对照,并做两组重复。35 ℃恒温培养24～48 h后观察试管内纸条是否变黑,变黑者记为阳性,不变者记为阴性。

e.柠檬酸盐试验:在斜面上用划线接种法接种分纯的菌株,于37 ℃下培养3 d到7 d并观察,若培养基中指示剂显色为蓝色或桃红色则为阳性,否则为阴性。

f.pH9.6和pH4.6生长试验:将菌种分别接于pH为9.6和pH为4.6的MRS液体培养基中,做两组重复,于37 ℃培养2 d,仔细观察菌株的生长现象。

g.糖发酵试验:将分纯的菌株接种于糖发酵液体培养基中的杜氏套管内,并设空白对照,28 ℃恒温培养,次日开始观察,一直到第7 d。判定实验结果,若小管内有气体产生记为阳性,不产气者记为阴性。做两组重复。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件整理分析实验数据,以及进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离纯化

从浆水样品中共分离出100株乳酸菌,编号为R-1～R-100,纯化后的菌株均保藏于斜面上。

2.2 初筛结果

2.2.1 最大吸收波长的测定 由图1可知,用紫外可见分光光度计，在200～300 nm波长范围内扫描双戊烯标准溶液时，出现了最大吸收峰,此时双戊烯标准溶液的吸光度最大,其对应的波长为215 nm,因此，双戊烯标准溶液的最大吸收波长为215 nm。

图1 双戊烯标准溶液紫外吸收光谱Fig.1 UV absorption spectrum of dipentene standard solution

2.2.2 双戊烯的标准曲线 按照1.2.5.1的方法操作,以吸光度(A)为纵坐标,双戊烯标准液的浓度(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线(图2),得线性回归方程:y=40x-0.2(R2=1),表明该实验方法合理,实验具有较高的可信度,可以采用该线性关系来计算发酵液中双戊烯的浓度。

图2 双戊烯标准品的标准曲线Fig.2 Standard curve of dipentene standard

2.2.3 初筛结果 结合分离纯化及1.2.5.2紫外检测发酵液产双戊烯的结果(见表1),选取有透明圈、表面光滑的乳白色菌落、革兰氏染色为G+的菌株共8株:R-14、R-17、R-3、R-32、R-8、R-12、R-23、R-40,以其中产双戊烯最高的五株菌株R-14、R-17、R-3、R-32和R-8作为初筛菌株进行后续复筛。

表1 产双戊烯乳酸菌的分离筛选Table 1 Isolation of producing-dipentene lactic acid bacteria strains

2.3 复筛结果

2.3.1 线性关系考察 按照1.2.6的方法,以双戊烯浓度为横坐标,以双戊烯与内标物的响应值之比为纵坐标,绘制标准曲线(图3),计算得回归方程:y=0.0052x+1.372(R2=0.9992),结果表明，双戊烯进样浓度在10～50 mg/L范围内,进样浓度与双戊烯和内标物的响应值之比呈良好的线性关系。

图3 GC-MS测定双戊烯的标准曲线Fig.3 Standard curve of dipentene standard by GC-MS

2.3.2 复筛结果 采用GC-MS方法,对上述R-14、R-17、R-3、R-32和R-8五株初筛菌株，在马铃薯番茄液体培养基中发酵产双戊烯的测定结果中可以看出,只有R-32在发酵液中检出产双戊烯,出峰时间是15.35 min,峰面积比为0.38%(结果见图4),双戊烯含量为0.171 μg/mL,故确定乳酸菌R-32为浆水发酵产双戊烯的优良菌株。

图4 菌株R-32产双戊烯的总离子流谱图Fig.4 Total ion chromatograms of GC-MS for producing-dipentene strain R-32

2.4 乳酸菌的鉴定结果

2.4.1 菌株产乳酸的鉴定结果 按1.2.7.1的方法,观察试管口滤纸是否变黑,发现试验组试管口的滤纸变黑,对照组试管口的试纸未发生明显变化(结果如图5),表明菌株R-32的发酵液中有乳酸,当发酵液中加入10%硫酸和2%高锰酸钾时乳酸就会转化为乙醛,再加热试管至沸腾时,乙醛散发会与滤纸条上含氨的硝酸银进一步发生反应使滤纸条变黑。

图5 菌株产乳酸的定性试验Fig.5 Result of qualitative test on lactic acid production

2.4.2 乳酸菌的形态学特征 按照1.2.7.2的方法,观察纯化后菌株R-32的菌落形态,结果见图6、表2;革兰氏染色后在光学显微镜下观察染色结果及菌体形态,结果见图7、表2。

图6 菌落特征图Fig.6 Colony characteristics

图7 乳酸菌R-32Fig.7 Lactic acid bacteria R-32

表2 纯菌的菌落及形态特征Table 2 Clone characterization of purified microorganisms

2.4.3 生理生化特性鉴定结果 按照1.2.7.4的方法对菌株R-32进行生理生化鉴定试验,结果如表3所示。

表3 菌株的生理生化实验结果Table 3 Results of physiological and biochemical characteristics of R-32 strain

根据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[20]、《伯杰氏细菌鉴定手册》[21],结合菌株产乳酸定性实验及形态学观察结果,对比张轶等[4]、张敏等[22]、孔彦卓等[23]的研究结果,乳酸菌菌株R-32符合肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)的生物学特性,故菌株R-32初步鉴定为肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)。

3 结论

本文采用经典的微生物分离方法,从浆水中分离出1株产双戊烯的乳酸菌菌株R-32,其在马铃薯番茄液体发酵培养基中产双戊烯含量可达到0.171 μg/mL;根据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》、《伯杰氏细菌鉴定手册》,结合形态学观察结果、测定生理生化指标及产乳酸定性试验的鉴定,本试验中筛分得到的乳酸菌菌株R-32与肠膜明串珠菌属(L.mesenteroides)的生物学特性十分相似,故鉴定可用于传统浆水发酵的产香乳酸菌株R-32为肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)，本研究中仅分离筛选了浆水中产双戊烯的乳酸菌,后续可对浆水酿制过程中其他特征风味优良产香菌株的选育做深入研究。