婴儿肠道菌群中乳酸菌的 分离鉴定及其多样性分析

周彦宏,李虹甫,陈思涵,林官根,刘昕宇,满朝新,徐红华,姜毓君

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

早期肠道菌群的定植很大程度上影响人体成年后的肠道菌群结构,而婴儿时期为肠道菌群定植的关键时期[1-2]。乳酸菌作为早期肠道菌群的主要组成部分,其多样性及丰度与婴儿肠道健康状况密切相关[3]。除生产及喂养方式外,早期抗生素干预一定程度上也会影响早期婴儿肠道菌群结构[4-6]。抗生素在攻击有害菌群时,包括乳酸菌在内的一些有益菌群也会遭受影响,且会促使某些细菌抗性基因的表达[7]。

传统培养方法可对肠道中获得的单一细菌菌株进行培养,有助于全面、完整地研究该种细菌的功能和不同生长条件下的生理活性[8]。应用传统培养方法分离肠道菌群，不仅有助于揭示肠道细菌对营养成分的利用情况和细菌之间的相互作用,且分离得到的乳酸菌菌株，可作为今后人源益生菌菌株筛选的潜在资源。但传统培养方法也仍存在很多的局限性与不足之处。除绝大多数肠道菌群不可培养外,体外培养体系也很难完全模拟微生物在肠道中自然生长繁殖的条件。随着以16S rDNA为基础的分子生物学发展,一些不依赖于培养的技术被应用于肠道菌群的研究,如Real time-PCR、DGGE、FISH和以Illumina高通量测序技术为首的第二代测序技术[9-12]。尽管这些方法可一定程度上提供更丰富的肠道菌群结构信息,但其费用高且耗时,有些研究手段只能检测出一定丰度上或处于低等分类学水平的菌群。基于PacBio Sequel平台的单分子实时测序技术，能够弥补上述核酸检测技术的缺陷,可对16S rDNA全长进行测序,更准确探究肠道菌群多样性和实现种水平上的深度分类[13]。然而,仅基于核苷酸序列的三代测序技术准确率稍低,不能分辨粪便样品中的死活菌,且无法获得单一菌株进行后续生理生化及功能特性分析。因此,将传统培养方法与三代测序技术相结合,不仅可获得单一纯化的乳酸菌,也可更准确地获悉肠道粪便样品中的微生物多样性。

本文采用传统培养与单分子实时三代测序技术结合的方法,对中国婴儿肠道菌群中的乳酸菌进行分离鉴定及多样性分析,且探究了抗生素对乳酸菌多样性的影响。通过对婴儿肠道菌群中乳酸菌的分离及多样性的探究,为后续人源益生菌发酵产品的开发提供菌种资源,并为婴儿健康发展提供有效技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

8份婴儿肠道粪便样品 通过问卷调查方式,选取符合实验要求的8份婴儿肠道粪便样品。根据是否在采样前后4周内接受抗生素治疗及抗生素种类分为阿莫西林组(A组,共2份)、美罗培南组(B组,共2份)和健康组(H组,共4份),婴儿选取标准:母亲无慢性基础疾病(包括糖尿病,类风湿性关节炎或慢性传染病及心肺疾病)及家族遗传病，除是否接受抗生素治疗外,胎儿胎龄、出生体重、生产及喂养方式等均无明显差异；MRS固体培养基、MRS肉汤培养基、磷酸盐缓冲液 天津市瑞金特化学品有限公司;2×Taq PCR MasterMix 北京天根生物技术有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司;QIAamp DNA Stool Mini Kit 德国QIAGEN公司。

RL-58GSP型低温采样箱 北京优冷科技有限公司;YQX-II型厌氧培养箱 上海龙跃仪器设备有限公司;厌氧产气袋 日本三菱化学有限公司;BXM-30R型高压蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;Bcn1360型生物超净工作台 北京东联哈尔仪器制造;3K-15型高速冷冻离心机 德国Sigma公司;7000 PCR扩增仪 美国Applied Biosystems公司;DYY-10C型电泳仪 北京市六一仪器厂;UVP凝胶成像系统 美国UVP公司;NanoDrop 2000超微量分光光度计 美国Thermo分光光度计公司;XW-80A型涡旋混匀器 上海医科大学仪器制造厂。

1.2 实验方法

1.2.1 婴儿肠道粪便样品的采集 在婴儿自然排便后,使用无菌采样管进行样品采集,采集过程中均为无菌操作。采集后立即放入低温采样箱中速冻,在2 h内送至实验室,其中一部分立即进行菌株分离,另一部分置于-80 ℃保存,用于粪便样品总DNA提取。

1.2.2 乳酸菌的分离鉴定 使用预还原的磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7)对粪便样品进行梯度稀释。选取10-3～10-6的稀释倍数,吸取100 μL涂布于MRS平板。将MRS置于厌氧培养箱中，37 ℃培养48～72 h,观察结果并记录。依据菌落形态、伯杰氏细菌鉴定手册和乳酸菌细菌分类鉴定及试验方法,采用生理生化实验初步对菌株进行分类学鉴定,包括过氧化氢酶试验、糖类发酵产酸试验等[14-15]。随后,采用细菌组DNA提取试剂盒,按照说明书提取单一纯化菌株的总基因组DNA。使用通用引物27F(5′-AGATTTGATCCTGGCTCAG-3′)及1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)针对16S rDNA进行PCR扩增,扩增条件如下:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,30个循环;72 ℃末端延伸7 min。将扩增后的PCR产物送至北京诺赛生物科技有限公司，进行纯化及双向测序,测序后，结果使用Contig Express软件进行序列拼接。拼接后的序列在NCBI上的BLAST数据库中进行比对,结合生理生化实验结果,选取相似度最高的菌种完成菌株鉴定。同时应用MEGA 7.0对乳酸菌16S rDNA序列构建系统发育树。

1.2.3 粪便总基因组DNA的提取及PCR扩增 采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取婴儿肠道粪便样品总DNA,具体步骤按照说明书进行操作。使用1.2.2中提到的通用引物进行16S rDNA全长扩增,扩增使用两步法,第一步扩增条件为:98 ℃预变性2 min;98 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,25个循环;72 ℃末端延伸5 min。第二步扩增条件为:98 ℃预变性2 min;98 ℃变性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,25个循环;72 ℃末端延伸5 min。扩增后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段大小,并采用NanoDrop检测其浓度和纯度。

1.2.4 数据分析 在QIIME中调用UCLUST序列比对工具,将测序序列生成相应OTU。根据OTU注释结果明确婴儿粪便样品中乳酸菌多样性分布。通过分析不同样品中OTU数据,计算样品的Alpha多样性,包括Shannon、Chao1、Simpson、ACE指数等。其中Chao1与ACE指数主要体现群落的丰富度,而Shannon与Simpson指数主要侧重群落的均匀度。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离及鉴定

2.1.1 乳酸菌的分离及初步鉴定 将收集到的8份不同来源的婴儿肠道粪便样品，经由MRS培养基培养后,挑取形态不同的单一菌落进行分离纯化。根据生理生化试验结果和菌落形态,初步确定从粪便样品中共分离出32株乳酸菌,其中阿莫西林组2株,健康组30株,美罗培南组没有分离到乳酸菌。

2.1.2 细菌总基因组DNA的提取及扩增 采用细菌基因组DNA提取试剂盒，对分离得到的32株初步鉴定为乳酸菌的菌株进行DNA提取,使用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,DNA提取电泳结果条带均正常且均一,因此挑选部分分离菌株的结果如图1所示。分离菌株的DNA条带在2000 bp以上且无杂带,说明DNA的提取结果符合后续PCR扩增要求。应用PCR对16S rDNA进行扩增,PCR扩增电泳结果条带正常且均一,因此挑选部分分离菌株的结果如图2所示。通过与标准条带比较,可观察到条带均在1500 bp左右,清晰单一且无引物二聚体,表明此PCR产物可用于后续基因测序。

图1 部分分离菌株DNA提取电泳结果Fig.1 The electrophoresis results of DNA extracted from part of isolated strains注:M为Marker DL2000;1～9为分离菌株基因组DNA。

图2 部分分离菌株的PCR产物电泳结果Fig.2 The electrophoresis results of PCR products form part of isolated strains注:M为Marker DL2000;1～10为分离菌株PCR产物。

2.1.3 乳酸菌分子生物学鉴定 将提取的乳酸菌菌株DNA经PCR扩增后，送至测序公司测序,采用NCBI上的BLAST数据库对测序得到的拼接结果进行序列同源性比对,获取菌株鉴定结果(见表1)。经统计,通过传统培养方法共分离得到32株乳酸菌,其中L.rhamnosus12株(b1～b12)、E.faecalis6株(a1,a2,b13～b16)、L.gasseri4株(b17～b20)、L.plantarum3株(b21～b23)、L.casei3株(b24～b26)、P.pentosaceus3株(b27～b29)、B.longum1株(b30)。使用MEGA 7.0对分离得到的32株菌株进行系统发育分析,揭示菌株的亲缘关系(见图3)。由系统发育树可知,所有菌株均聚集在相应参考菌株的分支上,证明鉴定结果正确,且不同样品分离出的菌株具有一定的同源性。

表1 培养分离的乳酸菌16S rDNA序列BLAST比对结果Table 1 The BLAST comparison results of 16S rDNA sequences of isolated lactic acid bacteria

图3 乳酸菌系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree of lactic acid bacteria

2.2 单分子实时测序

2.2.1 粪便样品物种丰度及多样性 利用QIIME软件，调用USEARCH检查并剔除嵌合体序列,剔除疑问序列后,对每个粪便样品的测序量进行统计,得到平均测序量为7863。随后,使用QIIME调用UCLUST序列比对工具,基于97%的相似水平确定样品中OTU数量(见图4)。其中,每个椭圆代表一组粪便样品,椭圆间的重叠区域表明组间的共有OTU,每个区块的数字表明该区块所包含的不同组别的共有或独有OTU数量。基于不同分类等级的平均OTU数量,整体抗生素组中微生物丰度显著小于健康组。Alpha多样性指数包括Chao1、Simpson、Shannon以及ACE指数,其中Chao1与ACE指数侧重于体现群落丰富度,而Shannon和Simpson指数侧重于体现群落均匀度。Alpha多样性各项分析指数也表明,除A1外,整体抗生素组的多样性指数低于健康组(见表2)。采用Mothur软件,调用Metastats分析对各个分类单元进行差异检验,两组微生物多样性在属及种水平上均存在显著性差异。对所有粪便样品整体分组所得到的OTU进行物种注释,结果表明，属、种水平为最佳分类水平,注释过程中，将丰度≤1%的属或种定义为Others(见图5、图6)。在属水平上,健康组中主要以Streptococcus(19%)、Veillonella(18%)为优势属;阿莫西林组以Enterococcus(65%)为优势属;而美罗培南组主要以Escherichia(92%)为主导且菌属单一。在种水平上,S.salivarius(18%)、V.parvula(15%)为健康组优势种;E.faecium(60%)为阿莫西林组优势种;E.fergusonii(91%)为美罗培南组优势种。以上物种分布情况说明，抗生素对肠道菌群稳态具有一定程度的破坏性,且不同种类的抗生素影响具有差异性。

图4 OTU划分和分类地位鉴定结果Venn图Fig.4 The OTU division and classification of status Venn diagram

图5 属水平微生物群落分布Fig.5 Distribution of gut microbiome at genus level注:乳酸菌及优势属均以字母标注:a:Escherichia, b:Enterococcus,c:Veillonella,d:Streptococcus, e:Lactobacillus,f:Pediococcus。

图6 种水平微生物群落分布Fig.6 Distribution of gut microbiome at species level注:乳酸菌及优势种均以字母标注:a-E:fergusonii,b-E:faecium, c-V:parvula DSM 2008,d-S:salivarius,e-L:rhamnosus GG,f-P:pentosaceus。

表2 Alpha多样性指数Table 2 The index of Alpha diversity

2.2.2 乳酸菌种类及分布 根据三代测序结果所示(见表3),阿莫西林组中乳酸菌丰度极小且种类单一,主要为E.faecalis。美罗培南组没有检测到乳酸菌。健康组中乳酸菌多样性较高,但普遍丰度较低(≤1%)且存在个体差异,其中L.rhamnosus为优势乳酸菌种,L.gasseri普遍存在于健康组肠道菌群中。该结果说明，抗生素的使用会减少婴儿肠道菌群中乳酸菌的种类,且不同种类抗生素的影响存在差异性。

表3 基于高通量测序的粪便样品中乳酸菌多样性(以丰度计,%)Table 3 Diversity of lactic acid bacteria in various fecal samples based on high-throughput sequencing(calculated by abundance,%)

3 结论

本文采用传统培养方法与基于PacBio Sequel平台的SMRT测序技术相结合的方式,分离鉴定婴儿肠道菌群中的乳酸菌菌株,并分析婴儿肠道菌群乳酸菌多样性及结构,同时探究抗生素使用对乳酸菌多样性的影响。首先,通过传统培养方法共分离得到32株乳酸菌,

经鉴定分别为:L.rhamnosus、E.faecalis、L.gasseri、L.plantarum、L.casei、P.pentosaceus与B.longum;同时,SMRT测序技术共获得11种乳酸菌,分别为L.rhamnosus、E.faecalis、L.gasseri、L.casei、P.pentosaceus、L.paracasei、L.salivarius、L.paraplantarum、L.porcinae、B.pseudocatenulatum、B.longum。通过两种分析方法结合的方式来看,相较于大多数西方国家的婴儿肠道菌群，中国婴儿肠道菌群含有较高丰度的乳酸菌,但乳酸菌多样性呈现出较低的态势,此结果与他人研究结果相吻合[16]。不同婴儿肠道菌群中乳酸菌多样性具有一定差异,但整体趋势上抗生素使用会影响婴儿肠道菌群乳酸菌多样性,且不同种类抗生素影响程度不同。相较于健康组,抗生素组仅分离检测到2种乳酸菌,分别为:E.faecalis以及L.porcinae。阿莫西林对婴儿肠道乳酸菌影响程度小于美罗培南,但这两种抗生素对婴儿肠道乳酸菌均具有破坏性的影响。其次,传统培养方法可培养出三代测序技术中丰度较低或未检测到的纯化乳酸菌菌株,如L.plantarum、B.longum,但三代测序技术获悉的乳酸菌多样性更高。通过两种方法结合,可更准确地揭示婴儿肠道菌群中乳酸菌的多样性及分布。

总体而言,本文采用传统培养与三代测序结合的分析手段，研究婴儿肠道菌群中乳酸菌多样性,不仅提出了一个分析肠道菌群的新思路,而且证明抗生素确实可显著降低婴儿肠道菌群中乳酸菌的多样性,为今后婴儿肠道菌群研究提供了新的理论与技术支持。且通过分离得到的乳酸菌纯化菌株,可为今后开发发酵乳酸菌制品提供新的菌种资源。