益气化瘀解毒方对人肝癌细胞MHCC97—H迁移能力及趋化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7表达的影响

郜文辉 曾普华 黄惠勇 叶书林 潘敏求 周芳 李为 刘丹

摘要：目的 观察益气化瘀解毒方对人肝癌细胞MHCC97-H迁移能力及趋化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7表达的影响，探讨其相关作用机制。方法 以索拉非尼为阳性对照，CCK-8法测定益气化瘀解毒方及索拉非尼对MHCC97-H细胞增殖的作用及最佳作用浓度，划痕实验观察MHCC97-H细胞迁移能力；Western blot检测药物干预24 h后CXCL12、CXCR4、CXCR7的蛋白表达。结果 益气化瘀解毒方及索拉非尼均能抑制MHCC97-H细胞生长，24 h半数抑制浓度分别为0.095 g/mL、10 μmol/mL；益氣化瘀解毒方及索拉非尼均有抑制MHCC97-H迁移的能力；经益气化瘀解毒方干预后，MHCC9-H细胞CXCL12、CXCR4、CXCR7蛋白表达量均下降。结论 益气化瘀解毒方能抑制MHCC97-H细胞增殖及迁移，其机制可能是通过下调CXCL12/CXCR4/CXCR7趋化因子轴发挥作用。

关键词：益气化瘀解毒方；索拉非尼；人肝癌细胞MHCC97-H；趋化因子

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.010

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）07-0041-03

Abstract： Objective To study the effects of Yiqi Huayu Jiedu Prescription on the migration ability of MHCC97-H and the expressions of CXCL12， CXCR4 and CXCR7； To discuss its relevant mechanism of action. Methods Setting Sorafenib as a positive control， CCK-8 method was used for determining the effects of Yiqi Huayu Jiedu Prescription on the cell proliferation of MHCC97-H and the optimum concentration. Scratch assay was used to observe the migration ability of MHCC97-H. The protein expressions of CXCL12， CXCR4 and CXCR7 were detected by Western blot after 24 h of medicine intervention. Results Yiqi Huayu Jiedu Prescription and Sorafenib can inhibit the cell proliferation of MHCC97-H ， and the inhibitory concentration was 0.095 g/mL and 10 μmol/mL at 24 hours. Yiqi Huayu Jiedu Prescription can inhibit migration ability of MHCC97-H. The protein expressions of CXCL12， CXCR4 and CXCR7 in hepatocellular carcinoma cells decreased after the action of Yiqi Huayu Jiedu Prescription. Conclusion Yiqi Huayu Jiedu Prescription can inhibit MHCC97-H cell proliferation and migration， which may be realized by down-regulating chemokine axis of CXCL12/CXCR4/CXCR7.

Keywords： Yiqi Huayu Jiedu Prescription； Sorafenib； MHCC97-H； chemokines

原发性肝癌（以下简称“肝癌”）具有起病隐匿、高度恶性、进展快、预后差和死亡率高等特点。目前临床上肝癌存在大多伴有肝病背景、治疗缺乏针对性、难治性耐药和源头创新药物少等问题。中药复方配伍具有多活性成分、多环节、多靶点的抗肿瘤特点，因此，从中医药寻求多靶点抗肝癌新药可望带来新的突破。本课题组前期研究显示，益气化瘀解毒方可调节免疫、稳定瘤体、抗侵袭转移，对肝癌低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）信号通路、肿瘤血管微环境等均有调节作用[1-6]。在前期研究的基础上，本实验观察益气化瘀解毒方对人肝癌细胞MHCC97-H细胞增殖、细胞迁移及趋化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7表达的影响，探讨其相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物及制备

益气化瘀解毒方（白参、黄芪、莪术、重楼、壁虎等），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院，用10倍温水浸泡30 min，先煎2 h，药渣再加8倍水煎煮2次，每次30 min。将3次煎液混匀，浓缩至200 mL，配制成益气化瘀解毒方母液，浓度为0.5 g/mL。滤纸粗滤，再用0.22 μm微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存。使用前稀释为0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125 g/mL。索拉非尼片，德国拜耳医药保健公司，批号700632，规格200 mg/片。研磨器碾成粉末，称取50 mg，溶于0.5 mL DMSO、9.5 mL PBS中，配制成索拉非尼母液（5 mg/mL），0.22 μm微孔滤膜过滤分装，-20 ℃保存，DMSO终浓度<0.1%。

1.2 细胞株

MHCC97-H细胞，北京北纳创联生物技术研究院。

1.3 CCK-8法检测MHCC97-H细胞增殖

取生长良好的对数期MHCC97-H细胞，0.25%胰酶消化，重悬，按细胞数为5×103，以100 μL/孔接种于96孔板培养。设实验组（100 μL不同浓度的益气化瘀解毒方、索拉非尼）、对照组（100 μL细胞悬液）、空白组（100 μL培养液）。培养24 h后实验组加入不同浓度的益气化瘀解毒方（终浓度分别为0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125 g/mL）、索拉非尼（终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/mL），每次处理5个复孔。孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK8培养1～4 h，于波长450 nm处测定吸光度（A），去除最高值和最低值后取其平均值，计算细胞增殖抑制率[1-（A实验组-A空白组）÷（A对照组-A空白组）]×100%，Graph PadPrism6.0绘制增殖抑制曲线，计算半数抑制浓度（IC50）。实验独立重复3次。

1.4 划痕实验观察MHCC97-H细胞迁移能力

分实验组和对照组进行干预。根据CCK-8实验结果确定益气化瘀解毒方、索拉非尼干预浓度分别为0.095 g/mL、10 μmol/mL，对照组为正常培养的MHCC97-H细胞。取对数生长期MHCC97-H细胞悬液，以3×105个/孔接种于6孔板，置于培养箱中培养，待细胞贴壁长满90%时，用10 μL移液枪头垂直均匀地在6孔板中间划“+”字。PBS冲洗2遍，加入含不同药物的含药培养基和无药物培养基，培养基均不含血清，排除细胞增殖影响。置于37 ℃、5%CO2培养，分别于0、24、36 h倒置光学显微镜下拍照，取“+”字上下左右4个点。细胞迁移距离（μm）=0 h平均距离-观察时平均距离，划痕平均距离用Image ProPlus计算。

1.5 Western blot检测趋化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7的蛋白表达

设实验组益气化瘀解毒方、索拉非尼药物浓度分别为0.095 g/mL、10 μmol/mL，对照组为不加药物常规培养的细胞，干预24 h。Western blot检测趋化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7的蛋白表达。提取细胞，加入蛋白裂解液制备总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。总蛋白于100 ℃加热变性10 min，取50 μg样品上样检测。按说明书配制SDS-PAGE胶电泳分离蛋白后，半干式电转膜仪17V，30 min将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST漂洗3×10 min，相关抗体于4 ℃过夜，TBST漂洗3×10 min，加入HRP标记的二抗（1∶5000）室温孵育1 h。TBST漂洗3×10 min后，用电化学发光法显影、定影。利用Tanon凝胶成像系统采集图像并进行吸光度检测，以目的条带和内存条带的灰度比值代表该目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.6 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析和q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 益气化瘀解毒方对MHCC97-H细胞增殖的影响

益气化瘀解毒方浓度分别为0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125 g/mL，其24 h抑制率分别为10.90%、70.69%、93.24%、97.73%，干预24 h IC50为 0.095 g/mL，见表1。索拉非尼浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/mL，其24 h抑制率分别为27.36%、46.39%、70.89%、96.71%和98.21%，干预24 h IC50为10 μmol/mL，见表2。

2.2 益气化瘀解毒方对MHCC97-H细胞迁移的影响

细胞划痕实验显示，经益气化瘀解毒方、索拉非尼分别处理24、36 h后，细胞划痕较对照组明显变宽。见表3、图1。

2.3 益气化瘀解毒方对趋化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7蛋白表达的影响

经药物干预后，MHCC9-H细胞CXCL12、CXCR4、CXCR7蛋白表达量较对照组均下降（P<0.01）。见表4、图2。

3 讨论

趋化因子对原发性肝癌的发生、发展及预后起着重要作用。其与受体相互作用能诱导靶细胞趋化性迁移，增强靶细胞与内皮细胞的黏附力等，广泛参与细胞的生长、发育、分化、凋亡等多种生理功能。CXCL12是趋化因子CXC亚家族成员，CXCR4和CXCR7为其同源受体。CXCL12/CXCR4参与多种肝脏疾病的过程，并与疾病的发生、发展密切相关。肝星状细胞通过CXCL12/CXCR4趋化因子轴诱导肝癌细胞侵袭和内皮-间质转化。CXCR4是肝癌增殖和侵袭转移过程中的关键因子之一，与肝癌恶性程度及治疗预后密切相关。肝细胞癌（HCC）中存在HIF-1α和CXCR7过表达，且CXCR过表达与HCC进展相关。CXCR4和CXCR7可激活ERK/MAPK、PI3K/Akt/mTOR、JAK/STAT3等信号通路，促进恶性肿瘤的进展。

益气化瘀解毒方是根据肝癌“虚、瘀、毒”的基本病机，经病证结合、精准配伍而成的临床效验方。该方以白参、黄芪等益气健脾，莪术、石见穿、壁虎、鳖甲等化瘀散结，重楼、半枝莲等清热解毒，全方共奏益气化瘀解毒之功。

本研究结果显示，益气化瘀解毒方可抑制MHCC97-H细胞迁移，其作用可能与调节CXCL12、CXCR4、CXCR7等趋化因子表达有关。

参考文献：

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[3] 曾普华，郜文辉，潘敏求，等.益气化瘀解毒方药对人肝癌HepG2细胞增殖和裸鼠移植瘤生长的影响[J].现代肿瘤医学，2014，22（1）：8-11.

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[6] 曾普华，叶书林，王佳佳.重楼皂苷Ⅰ对人肝癌细胞MHCC97-H增殖、周期、凋亡的影响[J].云南中医学院学报，2017，40（3）：7-10.