梅花鹿茸I型胶原对骨质疏松大鼠Wnt/β-catenin信号通路的影响

石晓征，李 娜，李晓华，曲晓波

（长春中医药大学，长春 130117）

鹿茸是一种极其珍稀名贵的动物药，具有“生精补髓，养血益阳，强筋健骨”之功效[1]。鹿茸中含有包括蛋白质在内的丰富的生物活性物质，其中以胶原蛋白含量最为丰富[2]。胶原蛋白是一种可以构成骨组织的结构蛋白，包括许多种类。 其中I型胶原广泛分布于皮肤、肌腱、骨骼等组织，可维持骨密度，常用于骨代谢性疾病及骨质疏松症的治疗[3]。鹿茸中含有丰富的I型胶原，是其强筋健骨的根本所在。骨质疏松症是一种全身代谢性骨病，临床上在老年人及绝经妇女群体中较为多见[4]。由于外界环境或自身原因导致的骨质量减少和成骨不足，会进一步引起骨微结构破坏和骨脆性的增加，形成骨质疏松。随着我国老龄化现象日趋严重，骨质疏松的发病率也随之大幅提高，严重影响人们的生活质量[5-6]。研究[7]发现，经典的Wnt/β-Catenin 信号通路因参与成骨细胞的增殖、分化过程，并影响其活性和功能，逐渐成为科研人员对防治骨质疏松症药物研究的热门方向。本课题组在此前的研究[8-12]中发现，梅花鹿茸胶原酶解物对其骨质疏松大鼠具有一定的防治作用，并成功从梅花鹿茸胶原酶解物中分离纯化得到梅花鹿茸I型胶原（SDC-I）。因此，本实验在前期工作基础上，进一步观察SDC-I对骨质疏松大鼠的保护作用，并探索其作用机制是否与Wnt/β-Catenin 信号通路的激活相关，为SDC-I对骨质疏松的防治提供实验数据和理论依据。

1 材料与方法

1. 1 动物 健康清洁级Sprague Dawley（SD）大鼠，雌性，50 只，体质量（200 ± 10） g，购自长春市忆斯实验动物技术有限责任公司，合格证号 SCXK（吉）2011-0004。

1.2 药品与试剂 SDC-I（相对分子质量 3.1×104，质量分数56.89%）制备，长春中医药大学分子药理实验室。Trizol，购自美国Invitrogen公司；DNA分子标记，cDNA第一链合成试剂盒，2×SYBR PCR扩增试剂盒均购自北京百泰克公司；溴化乙锭（EB），10×loading buffer购自日本Takara公司；引物合成，安徽通用生物系统有限公司。

1.3 主要仪器 分析天平，型号BT125D ，购自德国Sartorius 公司；冷冻离心机，型号5430R，双能X线骨密度仪，型号DPx-L，购自美国LUNAR公司；PCR仪，型号Mastercycler ，购自德国 Eppondorf 公司；核酸电泳仪，型号Min-Sub ，购自美国 Bio-Rad 公司；制冰机，型号FHB100，购自上海比朗公司；超微量紫外分光光度计，型号Colibei ，购自德国伯赫公司。

1.4 模型建立及分组给药 将50只SD雌性大鼠，随机分为5组：即空白组，模型组，SDC-I低、中、高剂量组。进行7 d适应性饲养，除空白组外，其余各组均进行双侧卵巢摘除手术，建立大鼠骨质疏松模型。空白组和模型组灌胃给药等量生理盐水，SDC-I低、中、高剂量组分别给予0.05、 0.1、0.2 g/kg SDC-I灌胃治疗，每周给药 6 d（每周日停药），连续给药90 d。

1.5 取材方法 给药90 d后，将大鼠禁食1 d。经腹主动脉取血，将血清进行分离后，放入 - 80 ℃冰箱中保存备用。取大鼠右后肢股骨，将其与肌肉等其他组织剥去并碎化后，放入事先准备好的无菌 EP管中，于- 80 ℃保存，备用。

1.6 检测指标

1.6.1 骨密度（BMD）测定 给药前应用X 线骨密度仪检测各组大鼠股骨的 BMD，停止给药后再次检测各组大鼠 BMD，观察给药前后大鼠 BMD变化情况[13]。

1.6.2 最大载荷测定 取各组大鼠左后肢股骨，剔除股骨上的肌肉及其他组织，称重。将取好的各组大鼠股骨置于生物力学测定仪基座上固定。启动仪器，当测定仪前端自动挤压股骨断裂时，记录数值[14]。

1.6.3 血清生化指标测定 应用 ELISA 方法测定各组大鼠血清骨钙素（BGP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）水平，具体操作步骤均严格按照各个试剂盒的说明书完成，应用酶标仪进行检测。

1.6.4 RT-PCR测定 将保存的各组大鼠股骨从- 80 ℃冰箱中取出，立即浸入液氮中，在液氮保护下，迅速研磨至细粉。应用Trizol法提取各组大鼠骨组织中的总RNA，并利用琼脂糖电泳检测。取适量RNA按照试剂盒说明进行反转录实验，其余样品加入1 mL无水乙醇，- 80 ℃保存备用。设置程序：1）45 ℃，50 min；2）70 ℃，10 min。反应结束后，应用超微量紫外分光光度计检测反转录液中cDNA的浓度。设置RT-PCR反应程序： 95 ℃，起始模板预变性。1）95 ℃，20 s；2）65 ℃，10 s； 3）72 ℃ ，30 s，循环40次，终止反应。以β-actin为内参基因，分析各组样品β-Catenin、LRP5 mRNA的相对表达量，进行差异比较。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物碱基序列

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0 软件处理数据，并进行Student’s t检验分析，数据以均数±标准差（x± s ）表示，以 P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SDC-I对大鼠体质量、BMD及最大载荷量的影响 见表2。

2.2 SDC-I对大鼠血清生化指标的影响 见表3。

2.3 各组大鼠股骨 β-Catenin、LRP5 mRNA 相对表达量比较 见表4。

表2 SDC-I对大鼠体质量、BMD及最大载荷量的影响（x± s ，n = 10）

表3 SDC-I对大鼠血清生化指标的影响（x± s ，n = 10） ng/mL

表4 各组大鼠股骨 β-Catenin、LRP5 mRNA 相对表达量比较（x± s ，n = 10）

3 讨论

研究[15]表明，Wnt/β-Catenin信号通路的失控和失衡与骨质疏松的发生关系密切。此信号通路可通过更新干细胞、诱导分化、使成骨细胞发生、抑制各类骨组织细胞凋亡等多种方式增加骨量及骨密度[16]。其中，β-Catenin是此信号途径中的最为关键的调控因子，稳定的β-Catenin聚集在细胞质内，当其转移至细胞核内，并与转录因子结合后，方可启动编码成骨细胞的特异性转录因子Runx2的转录，达到调控骨组织细胞分化、发生、促成骨形成的目的。β-Catenin需要通过Wnt与LRP5/6在胞外结合，激发胞内信号转导，从而使GSK-3β磷酸化失活，来维持自身的稳定[17-18]。LRP5作为Wnt信号转导的跨膜受体，不但可以稳定β-Catenin，还可以保护成骨细胞的增殖、功能和存活不受影响，也是骨量形成过程中不可缺失的一环[19]。因此，Wnt/β-Catenin途径是调控成骨细胞和骨形成不可或缺的重要信号转导通路。 当此通路信号传导失控时，将导致包括骨质疏松在内的多种骨骼性疾病的发生[20-21]。

本研究发现，大鼠双侧卵巢切除后，随着大鼠BMD的降低，β-Catenin 和LRP5 mRNA 的表达显著下降；而高剂量的SDC-I能在提高大鼠BMD 、最大载荷量及血清中的BGP水平的同时，有效上调β-Catenin和LRP5 mRNA 的表达。因此，SDC-I防治骨质疏松大鼠的机制可能是通过促进细胞内 β-Catenin 的稳定、集聚、转入到细胞核中，来激活 Wnt/β-Catenin 信号转导途径，促进成骨分化，从而发挥抗骨质疏松作用。后续实验将从去势大鼠骨质疏松模型中分离培养原代成骨细胞，结合基因敲除、miRNA等技术，深入探索SDC-I到底如何通过调控Wnt/β-Catenin信号通路发挥对骨质疏松防治作用，进一步阐明 SDC-I对骨质疏松防治作用的物质基础及分子机制。