超滤法测定天麻素与不同血浆的蛋白结合率

鲍慧玮，徐 阳，王 萌，杨 波*

（1.长春中医药大学药学院，长春 130117；2.长春医学高等专科学校，长春 130031）

天麻素（gastrodine）是天麻的主要化学成分，是 《中华人民共和国药典：一部》（2015年版）中天麻含量测定的指标成分之一[1-3]。现代药理研究[4-7]表明，天麻素在治疗神经系统疾病中疗效显著，包括对脑缺血再灌注损伤的保护作用、对帕金森病和老年性痴呆的防治作用、抑制神经性疼痛、对脑神经元的保护作用等方面。此外，天麻素还具有镇静催眠、抗炎、增强机体免疫力等作用[8-9]。药物的血浆蛋白结合率是药代动力学中的重要参数，与药物在体内的吸收、代谢、分布和排泄等密切相关，对其今后药物的研发和临床应用具有重要的意义，其高低直接影响药效的发挥和给药方案的制定。故本实验采用超滤法结合HPLC的方法对天麻素与小鼠、大鼠、家兔的血浆蛋白结合率进行研究与测定。

1 材料

1.1 仪器 LC-2030型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；超滤管（相对分子质量截留值10 kD，Millopore公司）；H1650R 型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；AB135-S型电子分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司）；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SK-1快速混匀器（江苏金坛市江南仪器制造厂）。

1.2 试药 天麻素（批号：110807-200205，中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱纯，美国FISHER公司）；超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均为分析纯。

1.3 动物及血浆 Wistar大鼠，体质量（200±20）g，雄性；ICR小鼠，雌雄不限，体质量（20±2）g；家兔，雄性，体质量（2.0±0.5）kg，合格证号：SCXK（吉）-2016-0003、SCXK（吉）-2016-0004，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。将小鼠、大鼠、家兔分别采用摘眼球、腹主动脉、耳缘静脉方式取血，置肝素润洗的离心管中，4 000 r/min离心10 min，取上清，置4 ℃冰箱中备用。

2 方法

2.1 色谱条件 Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇：水（10：90），体积流量1.0 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为220 nm，进样体积为 10 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 PBS溶液的配制 取磷酸二氢钾1.36 g，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液79 mL，用水稀释至200 mL，即得磷酸盐缓冲溶液（pH 为7.4）。

2.2.2 对照品溶液的配制 取天麻素对照品约50 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，制得浓度为5.014 mg/mL的天麻素对照品储备液。精密吸取对照品储备液2 mL，置10 mL量瓶中，加入PBS溶液稀释至刻度，即得浓度为1.002 8 mg/mL的天麻素对照品溶液。

2.2.3 血浆样品溶液的处理 取已配制好的对照品溶液，分别精密移取5、20、50 μL于EP管中，再取小鼠、大鼠、家兔血浆950 μL分别加入上述溶液中（PBS溶液补足体积至1 000 μL），混匀，制得浓度分别为5、20、50 μg/mL的低、中、高3种天麻素血浆样品溶液，置37 ℃水浴温育2 h。分别吸取天麻素血浆样品溶液500 μL至超滤管中，6 000 r/min离心20 min，即得不同浓度的超滤液。

2.2.4 空白血浆超滤液的配制 精密吸取PBS溶液50 μL置EP管中，再取小鼠、大鼠、家兔血浆950 μL分别加入其中，置37 ℃水浴温育2 h。按照2.2.3项下制得空白血浆超滤液。

3 结果

3.1 系统适应性与专属性 取上述对照品溶液，小鼠、大鼠、家兔血浆样品超滤液和空白血浆超滤液按照2.1项下色谱条件进行分析，色谱图见图1（插页一）（小鼠、大鼠、家兔血浆色谱峰基本相同，以大鼠血浆为代表）。如图1所示，天麻素对照品峰形较好，理论塔板数不低于5 000，与其他色谱峰分离度较好，且无干扰，专属性较好。

3.2 方法学考察

3.2.1 线性关系考察 精密称取11.20 mg的天麻素对照品至10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，即浓度为1.120 mg/mL的天麻素对照品母液。分别吸取天麻素对照品母液 10、20、50、100、300、600 μL置10 mL量瓶中，PBS稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.12、2.24、5.6、11.2、33.6、67.2 μg/mL的系列对照品溶液。按照2.1项下色谱条件进入高效液相色谱中，记录峰面积。以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。求得回归方程：Y = 20 358 X - 307.03，r = 0.999 9，天麻素在1.12～67.2 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

3.2.2 稳定性试验 取2.2.2和2.2.3项下天麻素对照品溶液和大鼠中浓度血浆样品超滤液，分别在0、2、4、6、8、12 h注入高效液相色谱仪中，记录色谱峰面积，计算RSD值。结果表明，天麻素对照品溶液和中浓度血浆样品超滤液峰面积的RSD值分别为0.23%和0.54%。

3.2.3 重复性试验 分别取6份2.2.2项下对照品溶液20 μL，按照2.2.3项下制得大鼠血浆样品超滤液，在2.1色谱条件下进行含量测定。结果表明，血浆样品超滤液浓度的RSD值为0.77%，该方法重复性良好。

3.2.4 精密度试验 取2.2.2和2.2.3项下天麻素对照品溶液和大鼠中浓度血浆样品超滤液，按照2.1项下色谱条件1 d连续进样6次，记录色谱峰面积，计算日内精密度的RSD值；连续进样6 d，记录色谱峰面积，计算日间精密度的RSD值。结果表明，天麻素对照品溶液和中浓度血浆样品超滤液的日内精密度RSD值分别为0.89%、1.01%；日间精密度RSD值分别为1.25%、0.93%，该方法精密度良好。

3.2.5 回收率试验 取2.2.2项下天麻素对照品溶液，分别精密移取5、20、50 μL于EP管中，加入PBS至体积为1 000 μL，混匀，可得浓度为5、20、50 μg/mL的天麻素- PBS溶液，置37 ℃水浴温育2 h。再各吸取500 μL溶液转移至超滤管中，6 000 r/min离心20 min，制得低、中、高3种浓度的超滤液。按照2.1项下色谱条件进行分析，与相应浓度对照品溶液的峰面积比较，计算回收率。结果表明，3种浓度的平均回收率分别为99.82%、98.99%、97.45%，RSD值分别为1.82%、1.91%、1.55%，超滤膜对天麻素无特异性吸附。

3.3 血浆蛋白结合率测定 取2.2.3项下小鼠、大鼠、家兔不同浓度的超滤液，按照2.1项下色谱条件进行分析，记录峰面积，计算其血浆蛋白结合率[10]，见表1。

式中：C超滤前为超滤前含药物的PBS溶液的浓度；C超滤后为相应血浆样品超滤液的浓度。

表1 不同血浆的蛋白结合率测定结果（x± s ，n = 3）

由表1结果表明，天麻素与小鼠、大鼠、家兔血浆均属于低强度结合，家兔的血浆蛋白结合率略高于小鼠和大鼠，但无显著性差异，无浓度依赖性。

4 小结

4.1 测定方法的选择 常用血浆蛋白结合率的测定方法有平衡透析法、微透析法、超滤法等[11-13]，由于平衡透析法和微透析法试验耗时较长、浓度稀释、体积变化等影响因素较多，故本试验选用操作简便、影响因素较少的超滤法。

4.2 温育时间的选择 预试验中，考察了天麻素与血浆蛋白结合的温育时间[14]。在正常人体温37 ℃下，分别考察温育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h时天麻素的血浆蛋白结合率。结果表明，温育2.0 h时天麻素与血浆蛋白的结合已基本稳定，故最终的温育时间为2.0 h。

4.3 超滤条件的选择 采用10%高氯酸溶液检查血浆样品超滤液中是否有蛋白，以不漏出蛋白且超滤液体积与超滤前总体积之比在0.3～0.6范围内为标准[15]，确定最终超滤时的离心条件为6 000 r/min离心20 min。

4.4 天麻素的血浆蛋白结合率 本文采用超滤法结合HPLC法测定天麻素与小鼠、大鼠、家兔的血浆蛋白结合率，结果表明，天麻素与不同种属动物的血浆蛋白均属于低强度结合，家兔的血浆蛋白结合率略高于小鼠和大鼠，但是无显著性差异，且无浓度依赖性。故为天麻素的药物临床前研究提供了剂量和安全性的依据。