鞘内注射牛痘疫苗接种家兔炎症皮肤提取物对腰椎间盘突出大鼠的抗炎镇痛作用

2018-10-19 07:37李明明马民玉
中国疼痛医学杂志 2018年10期
关键词:乐平鞘内腰椎间盘

张 宇 李明明 马民玉

(郑州大学第一附属医院疼痛科,郑州 450052)

腰椎间盘突出症是一种临床常见病和多发病,以30~55岁的青壮年多见,且其发病率呈逐年上升趋势。由于其病程长,反复发作,发作时引起剧烈的神经源性疼痛及痛觉过敏伴活动受限,严重影响病人的健康和生活质量[1,2]。

神经妥乐平(NTP)是从接种牛痘病毒疫苗的家兔组织中提取而成的一种非蛋白小分子生物活性物质,可通过抑制大鼠背根神经节神经元P物质的释放及抑制激肽释放酶的合成而产生镇痛效果[3]。体外研究发现,NTP可降低人椎间盘细胞COX-2和TNF-α的表达[4],提示它可以调节炎性细胞的功能,减少炎症细胞因子的表达,抑制过度的炎症反应,减轻神经根的炎症损伤而产生镇痛作用。

目前国内外相关文献多集中探讨神经妥乐平对神经病理性疼痛的整体作用,尚未见有关神经妥乐平对腰椎间盘突出抗炎作用的行为学及分子学机制方面的报道。因此,本实验建立大鼠腰椎间盘突出模型,观察其对腰椎间盘突出大鼠的镇痛作用及对脊髓背根神经节炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达的影响,进一步为神经妥乐平在腰椎间盘突出症的临床用药方面提供更加精确的理论依据。

方 法

1.实验动物及分组

选用健康成年雄性清洁级的SD大鼠15只,体重220~250 g,由河南省实验动物中心提供[许可证号:SYXK(豫)2011-0001]。实验动物均分笼饲养,室温保持22±2℃,相对湿度50%~60%,12 h~12 h昼夜循环照明;大鼠自由进食和饮水。实验前使大鼠适应环境一周。本实验经郑州大学第一附属医院动物实验伦理委员会的批准,所有操作均遵守国际疼痛研究会相关指南及《实验动物使用规范》,所有动物实验符合医学伦理学标准。采用随机数字表法将其随机分为3组(n= 5):实验组(LDH + NTP 组)、假手术组(Sham组)及对照组(LDH + Saline组)。

2.实验模型制备及方法

(1)鞘内置管

采用改良Yaksh法[4]行大鼠鞘内置管:腹腔注射10%水合氯醛300~350 mg/kg麻醉,待钳夹大鼠肢体无反应后即可准备手术。常规备皮、消毒,以两侧髂棘为骨性标志,其连线为L6棘突,向上三个间隙即为L3-L4棘间,此为手术切口中心。以此为中心,在腰部作一长约1~1.5 cm的纵向切口,依次切开皮肤及皮下筋膜,暴露肌层。持止血钳上提L3棘突,以利于暴露椎间隙,用23G针针头刺破L3-L4棘间硬脊膜,并向头端置入PE-10导管至脊髓腰膨大处,置管深度约3 cm,如有清亮的脑脊液留出、出现甩尾或抖动反射表明置管成功。在导管置入端打结,并用1号丝线将其固定于皮下筋膜上,用25G硬膜外穿刺针经皮下隧道将导管妥善固定在大鼠颈部,外露约2~3 cm,以便于给药。用止血钳夹闭导管远端,防止脑脊液外流。用生理盐水冲洗伤口,伤口撒青霉素粉4万U,最后依次缝合各层,碘伏消毒后将大鼠置于温暖、安静、干净、避强光的环境中分笼饲养。术后注意预防感染。术后一天向管内注射 10 μl的2%利多卡因,如果大鼠后肢出现运动功能障碍,证明置管成功。取材时若出现导管置入位置不准确者将不纳入实验中。

(2)建立腰椎间盘突出(LDH)模型神经病理性疼痛大鼠模型

参照Shu-Xun H等[5]建立的通过大鼠自体髓核移植制备大鼠LDH模型的方法:腹腔注射10%水合氯醛300~350 mg/kg麻醉,待钳夹大鼠肢体无反应后即可准备手术。备皮、消毒,以L5棘突为中心,于背部作一纵形切口,所有手术操作均在左侧进行。切开皮肤、皮下组织及肌筋膜,分离棘突旁的肌肉,暴露横突,咬除左侧L4-5椎板、L5关节突,暴露L5神经根及DRG。橡皮筋结扎鼠尾根部,于鼠尾根部距肛门1 cm处作一纵形切口,切开皮肤、皮下组织至尾椎骨面,向两侧分离,充分显露尾椎间隙,横向切开尾椎纤维环取出2个椎间盘的髓核组织,移植至左侧L5DRG周围。用生理盐水冲洗伤口,伤口撒青霉素粉4万U,最后依次缝合各层,碘伏消毒后将大鼠置于温暖、安静、干净、避强光的环境中分笼饲养。术后注意预防感染,模型大鼠出现左足蜷缩、畏惧着地、患肢自觉抬起的现象,且足底机械痛阈明显下降视为手术成功。

(3)鞘内给予神经妥乐平

实验组(LDH + NTP组):鞘内置管,置管7 d大鼠恢复正常后制备LDH模型,术后3 d开始行NTP(生产批号:14045日本脏器制药株式会社)10 μl鞘内注射,每天1次,连续给药7 d;假手术组(Sham组):鞘内置管,置管7 d大鼠恢复正常后制备假LDH模型,仅显露硬脊膜及左侧L5 DRG,不进行自体髓核移植,术后3 d开始行生理盐水10 μl鞘内注射,每天1次,连续7 d;对照组(LDH + Saline组):鞘内置管,置管7 d大鼠恢复正常后制备LDH模型,术后3 d开始行生理盐水10 μl鞘内注射,每天1次,连续7 d。每组每只大鼠均进行行为学测试,结束后取大鼠L3-L5背根神经节,用Western-blot法检测L3-L5DRG中炎症细胞因子的表达。

3.检测大鼠机械痛阈

机械缩足阈值(PWT)测定:LDH术前1 d、术后3 d及鞘内给药后1 d、3 d、7 d时测定PWT。行为学测试前三天每日将大鼠放在透明塑料鼠笼中20~30 min适应。每次测定时间均在8:00~12:00 am,所有行为学测试均由同一人完成,测试人员不知道大鼠分组情况。参照Chaplan等“up and down”方法,于安静、光线充足的实验环境内,将大鼠放置于金属网格(1 cm×1 cm)上的透明塑料鼠笼(20 cm×20 cm×20 cm)内,金属网格架空,大鼠于鼠笼内可自由活动。放置20~30 min,大鼠安静后,透过网孔使用特定的Von Frey纤维丝(0.4 g、0.6 g、1 g、2 g、4 g、6 g、8 g、15 g)垂直刺激大鼠左后足底中部,避开不敏感的足垫部,观察并记录大鼠的反应。von Frey纤维丝刺激的力度:应使纤维丝弯曲成S形(90°~120°),刺激时间4 s,若大鼠出现迅速缩足、后足抬起、快速甩尾、舔足、嘶叫等反应,则记为“O”,没有上述反应则记为“×”(每个刺激强度允许适当重复,尽量避免误差)。首先从2.0 g的von Frey纤维丝开始,若缩足反应为阴性,则选用增大一个强度的von Frey纤维丝继续刺激;若缩足反应为阳性,则选择减少一个强度的von Frey纤维丝刺激,如此反复。停止刺激的条件:①von Frey纤维丝最大刺激强度15 g刺激时仍为阴性反应(此时以15 g作为机械痛阈值)。②第一次出现阳性反应后,应用“up and down应法连续测试4次。③应用“up and down”法累计测试总次数达9次。刺激间隔时间30 s,使大鼠完全恢复。测试结束,应用特定的软件,将刺激强度(g)转换成缩足阈值(N)(推算公式为50% PWT(g) =(10[Xf+κδ])/10 000,Xf为序列中最后一根von-Frey纤毛的对数值,δ为各个纤毛力度取对数后的均差,κ查表得来)。

4.检测大鼠DRG中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达

鞘内给药7 d后,行为学测试后处死大鼠,提取DRG组织,组织裂解液裂解后用电动匀浆器研磨,充分匀浆后置于4℃冰箱90 min,使其充分裂解,然后将组织液放入低温离心机离心(4 ℃,12 000 rpm,20 min),取上清液用BCA法测定蛋白浓度。待测样品加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,放入100℃沸水使其变性10 min,冷却后分装。取50μg/孔蛋白样品上样,进行 SDS-PAGE电泳,电泳结束后切取目的蛋白,转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭2 h后加入相应的多克隆一抗IL-1P(1:150,武汉博士德生物武汉)、IL-6(1:150,武汉博士德生物武汉)、TNF-α(1:200,武汉博士德生物武汉)和β-actin(1:1 000,武汉博士德生物武汉),4℃摇床过夜,洗膜后加入相应的二抗孵育,采用ECL发光试剂盒(武汉博士德生物武汉)和化学发光成像系统(ProteinSimple美国),曝光洗片,扫描图像后用图像分析系统对Western 蛋白条带进行分析,蛋白的相对含量用目的蛋白条带与内参条带光密度的比值表示,按计量资料进行统计分析。

5.统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,实验数据结果采用均数±标准差(±SD)表示,各组数据根据分布的情况选用不同的统计方法。组内比较采用重复测量资料的方差分析,多组定量资料的比较采用One-way ANOVA单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,以P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1.各组大鼠机械刺激缩足阈值(PWT)的测定与比较

所有大鼠术后均未出现肢体自噬现象,均可正常饮食饮水,但LDH + NTP组及LDH + Saline组大鼠易激惹、活动频繁,随着LDH + NTP组用药时间的延长,大鼠行为逐渐恢复。

与基础PWT相比,Sham组术后各时间点左后足底机械刺激缩足阈值无明显变化,LDH + NTP组及LDH + Saline组大鼠左后足底机械刺激缩足阈值明显降低;第一次给药后1 d、3 d、7 d,LDH + NTP组PWT高于LDH + Saline组,差异有统计学意义(P< 0.05,见图1)。结果表明:自体髓核移植可引发大鼠的痛觉过敏;鞘内注射NTP可缓解LDH大鼠的痛觉过敏。

2.各组大鼠DRG中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达变化

IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白在三组大鼠DRG中均有表达,与Sham组相比,LDH + NTP组与LDH +Saline组表达明显增加,差异有统计学意义(P< 0.05);但LDH + NTP组表达低于LDH + Saline组,差异有统计学意义(P< 0.05,见图2)。结果表明:LDH大鼠DRG中炎症细胞因子的表达增加,而鞘内注射NTP可减少LDH大鼠DRG中炎症细胞因子的表达。

图1 LDH大鼠术后不同时间点PWT变化(±SD)**P < 0.01,与 Sham 组相比;#P < 0.05,与 LDH +Saline组相比Fig.1 Changes of PWTs at different time points in rats after LDH operation in each group (±SD)**P < 0.01, compared with Sham group; #P < 0.05,compared with LDH + Saline group.

讨 论

LDH导致腰痛和坐骨神经痛的病理生理机制非常复杂,目前认为LDH引起疼痛的主要原因包括机械性直接压迫神经根和免疫性炎症反应,两者共同作用导致临床常见的腰痛及受累神经根的放射性疼痛[6,7]。神经根组织无论受到何种因素损伤都可以使得炎症部位的细胞膜释放磷脂,并降解为花生四烯酸,由此转化为强效的炎症致痛物质前列腺素和白三烯,即周围性疼痛致敏物质[7,8],受到直接性压迫后发生组织缺血、缺氧、水肿,这是产生典型临床症状的重要诱因。本实验参照Shu-Xun H等[9]制备大鼠LDH模型的方法,将自体髓核移植至大鼠背根神经节,可较好的诱导出大鼠神经行为学的改变,更接近于临床,而未产生明显的运动功能障碍。本实验结果表明,LDH模型后大鼠出现左足蜷缩、畏惧着地、患肢自觉抬起的现象,术后三天至一周左右即可出现明显的痛觉过敏,与Xiang Zhu等[10]的研究结果相符,均提示本模型成功。

LDH是引起坐骨神经痛最常见的原因,目前越来越多的学者关注其是否与免疫机制有关,尤其是自身免疫的机制[11~13]。近年来,许多研究发现免疫细胞和免疫细胞所产生的免疫因子是 LDH神经损伤的一个重要的免疫学机制[14~16]。LDH动物模型中,炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的表达明显增加,而这些炎症细胞因子有明显的致痛觉过敏作用。本研究发现腰椎间盘突出大鼠DRG中炎症细胞因子的表达增加,亦提示神经根的炎症与腰椎间盘突出致神经根痛的发生发展密切相关。神经根的炎症反应是腰椎间盘突出所引起的一系列病理生理改变的启动环节。炎症反应释放的化学介质如细胞因子等,能够敏化和刺激伤害性感受器,进而引发痛觉过敏。此外有研究证实,NSAIDs药物可通过抗炎镇痛作用缓解腰椎间盘突出病人临床症状;使用COX-2抑制剂[17]、抗炎症细胞因子的抗体,可降低髓核移植引起的机械及热痛觉过敏;应用TNF-α抑制剂,可抑制髓核移植引起的形态学改变及疼痛学行为改变[18]。因此,抑制神经根的炎症反应,可缓解腰椎间盘突出所致神经根痛的症状。

图2 大鼠DRG中炎症细胞因子的相对表达(±SD)*P < 0.05,与Sham组相比;#P < 0.05,与LDH + Saline组相比Fig.2 Relative expression of inflammatory cytokines in DRG of rats(±SD)*P < 0.05, compared with Sham group; #P < 0.05, compared with LDH + Saline group.

本实验建立大鼠腰椎间盘突出模型,观察鞘内注射神经妥乐平对腰椎间盘突出大鼠的镇痛作用及脊髓背根神经节炎症因子表达的影响,实验结果表明,鞘内注射神经妥乐平可明显提高腰椎间盘突出大鼠的机械刺激缩足阈值,减轻腰椎间盘突出大鼠的痛觉过敏;与对照组相比,鞘内注射神经妥乐平可明显减少背根神经节中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。

综上所述,本研究结果显示,神经妥乐平可通过下调炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,可以调节炎性细胞的功能,减少炎症因子的表达,抑制过度的炎症反应,减轻神经根的炎症损伤,对腰椎间盘突出症大鼠产生抗炎镇痛作用,但神经妥乐平下调炎症因子表达的机制仍需进一步研究。

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