小鼠脏器荧光信号的观察

黄昭帅，林武，陈肖鸣

（温州医科大学附属第一医院 小儿外科，浙江 温州 325015）

小鼠和人体中的自发荧光具有普遍性[1-2]。在观察特定组织的分布时，自发荧光可能会对目的荧光造成影响，此时需要消除自发荧光，去除干扰免疫染色的背景，但研究也发现，自发荧光在组织的识别鉴定以及新的标志物的发现与应用中发挥一定作用[3-4]，因此，本研究观察小鼠脏器组织中的自发荧光状况，以及利用硫酸铜溶液去除自发荧光的效果，探索可用于观察注射到小鼠体内的目的荧光的适宜脏器。

1 材料和方法

1.1 试剂 硫酸铜购于美国Fisher Scientific公司；醋酸铵购于美国Sigma公司；DMEM基础培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶乙二胺四乙酸（EDTA）购于美国Gibco公司；双抗（100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素）购于美国Invitrogen公司。

硫酸铜溶液配置：将1.927 g醋酸铵加入超纯水，最后定容到50 mL，制成10×的0.5 mol/L储备液。将7.9805 g硫酸铜加入到50 mL超纯水中，制备1 000×的1 mol/L储备溶液。在40 mL超纯水中加入5 mL 10×的醋酸铵储备液，再加入50 µL 1 000×的硫酸铜储备液，将pH值调节成5，最后定容到50 mL硫酸铜醋酸铵液体（1 mmol/L硫酸铜、50 mmol/L醋酸铵）。

1.2 细胞和动物 大鼠脑胶质瘤（RG2）细胞系由美国佛罗里达州立大学任艺教授惠赠。

4～6周龄SPF级C57/BL6小鼠8只，雌性，体质量18～22 g，购于美国Jackson Laboratory，并在特定无病原体的动物设施中饲养。动物实验经美国佛罗里达州立大学实验动物保护和使用组委会同意。

1.3 细胞实验

1.3.1 细胞培养：冻存的细胞系RG2从液氮罐中取出后，迅速于37 ℃水浴至融化，离心后弃上清，于配制好的含5% FBS、1%双抗的DMEM培养液中轻轻吹打均匀，置于5% CO2，37 ℃的细胞培养箱中培养。

1.3.2 细胞分组和处理：细胞系RG2经适应性培养（传代4次）后，传代分成对照组和处理组。将2组细胞置于培养箱中，等细胞成熟贴壁后，使用磷酸盐缓冲液洗去培养液，并用4%多聚甲醛固定。处理组：使用上述配置的硫酸铜溶液10 min，经蒸馏水润洗后，荧光胶封片；对照组：未经硫酸铜处理，直接荧光胶封片。

1.4 动物实验

1.4.1 小鼠分组和处理：小鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组和尾静脉注射组，每组4只。尾静脉注射组：收集细胞系RG2，将细胞重悬于其基础培养基，浓度调节成106/mL，放于4 ℃冰盒中保存，经尾静脉注射100 µL细胞悬液入小鼠体内，3 d后处死小鼠，经心脏灌注后取下小鼠肺、肝脏以及脾脏。正常组：直接经心脏灌注后取下小鼠肺、肝脏以及脾脏。将收集好的小鼠脏器存放于-80 ℃冰箱保存待冰冻切片。

1.4.2 冰冻切片：将切好的正常组和尾静脉注射组小鼠脏器冰冻切片贴片放在室温30 min，使用PBS溶液润洗3次，每次5 min，再使用蒸馏水清洁1次，用配置好的硫酸铜醋酸铵混合液处理10 min，经蒸馏水润洗后，使用1∶1 000 Hoechst（溶解于1%PBS溶液中），孵育玻片10 min，显微镜观察核染色效果，使用PBS溶液清洗，荧光胶封片。

1.5 荧光信号观察 用Nikon倒置荧光显微镜拍照，使用配套NIS软件对小鼠脏器进行随机拍照（每一脏器切片获取15～20张×200的图片，重复3次，共得到45～60张图片），观察脏器中是否存在荧光信号。

2 结果

2.1 细胞荧光分析 对照组的细胞荧光强度比处理组强，见图1。

图1 RG2细胞经过硫酸铜处理前后荧光强度变化（×200）

2.2 小鼠脏器荧光观察

2.2.1 脾脏：正常组小鼠脾脏冰冻切片在硫酸铜醋酸铵溶液处理前，可见大量绿色荧光背景（见图2A-B）；硫酸铜处理后绿色荧光背景明显减弱，但是仍然有其他荧光物质（见图2C-D）。

2.2.2 肺和肝脏：正常组小鼠肺和肝脏荧光背景很弱（见图3A、C），尾静脉注射组小鼠肺和肝脏可以清晰地分辨荧光细胞（见图3B、D）。

3 讨论

图2 硫酸铜溶液处理前后脾脏的荧光背景变化（×200）

图3 小鼠肝脏、肺组织内RG2荧光细胞观察

啮齿类动物和人体组织（比如神经系统、胃肠、乳房[5]）含有大量的自发荧光信号。许多内生的荧光基团已被鉴定，例如芳香族氨基酸、细胞角蛋白、胶原蛋白/弹性蛋白、NAD（P）H、黄素、脂肪酸、维生素A、卟啉和脂褐素，这些分布在细胞内外的内在荧光信号可以根据它们的荧光信号范围、分布和形态进行区分和鉴别，因此可以在疾病诊断、疾病恢复程度的判定等方面发挥作用。比如细胞内存在多种内源性荧光团可以揭示新陈代谢的重要过程[6-7]，肿瘤组织的代谢方式改变引起烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）与黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的比例变化[8]，这两种荧光变化可以作为鉴别肿瘤组织的指标[9]。另外在外科手术中，甲状旁腺的组织鉴别常常困扰外科医师，运用甲状旁腺的自身荧光特性可有助于手术切除范围的界定[10-13]。尽管自发荧光有上述作用，但是在观察目的荧光时需要消除自发荧光的影响，主要方法包括苏丹黑B和硫酸铜。研究表明苏丹黑在小鼠的肾脏和人体的脑、胰腺中能有效消除自发荧光[4，14-15]；硫酸铜对组织中的红细胞的荧光信号淬灭也非常有效[16]，铜离子可以接受来自脂褐素中的电子，从而逆转荧光信号的释放。短效的硫酸铜溶液处理能够快速有效地消除背景并且确保目的信号的保存[17]。

本研究发现细胞体外实验中荧光细胞（RG2）信号可被削弱；在动物试验中，C57/BL6小鼠3个脏器中，肺和肝脏中几乎无明显自发荧光，而小鼠脾脏中的自发荧光最为突出。自发荧光差别的主要原因可能与残留的红细胞相关：经过心脏灌注后，肝脏、肺脏能够迅速排除血液，而脾脏特异的血管分布、内在结构使红细胞残留，因而造成脾脏荧光背景的特殊性；脾脏也是人体最大的免疫器官，含有大量的免疫细胞包括巨噬细胞等，这些免疫细胞也参与脾脏自发荧光背景的形成。在本研究中，通过硫酸铜的处理，脾脏中仍有其他的荧光信号不能被硫酸铜所消除，考虑该荧光来源为某些内在巨噬细胞及其他类型细胞，研究也发现，如果心脏灌注后，肺和肝脏去除血液效果较差，可考虑硫酸铜溶液处理。因此本研究认为通过有效的心脏灌注并且以肺脏或肝脏为观察器官可达到观察外源信号的优良效果。