TNF-α及TNF-α抗体对破骨细胞V-ATP酶的影响

王潇 陈健* 张鑫 何剑全 黄慧

1. 厦门大学医学院，福建 厦门 361000 2. 厦门大学附属中山医院康复科，福建 厦门 361000

破骨细胞作为体内唯一的骨再吸收细胞，它通过与骨表面之间形成微环境来降低骨基质的成分[1]，所以破骨细胞是骨质疏松和骨折预防和治疗方面的重要靶点。研究表明，在骨吸收的过程中，附着于骨骼表面的破骨细胞在酸性的条件下先溶解骨矿物质，继而降解骨基质成分。在此过程中，V-ATP酶的表达对骨吸收所必需的酸性微环境起到了至关重要的作用[2,3]。肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)对破骨细胞V-ATP酶表达的影响尚不十分明确。本实验通过观察TNF-α及TNF-α抗体对破骨细胞V-ATP酶的影响，来探讨TNF-α提高破骨细胞的骨吸收活性的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购于上海傅衡生物科技有限公司，核因子κB受体活化因子配体(RANKL)(PeropTech,USA)，TNF-α(PeropTech,USA)，TNF-α抗体(abcam)，胰蛋白酶(GIBCO)，双抗(HyClone)，胎牛血清(Biological Industries)，DMEM培养基(GIBCO)，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP) 染色试剂盒(Sigma)，TRIZOL(ambion)，RNA 逆转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)(TaKaRa)，荧光定量PCR 试剂(TaKaRa)，V-ATP酶抗体(GenScript)，引物(上海生工)，PCR扩增仪(普通mycycler) (BIO-RAD，美国)，ABI 7500 型荧光定量PCR仪(美国ABI)，FluorChem HD2成像系统(美国Protein slmple)。

1.2 破骨细胞的诱导及鉴定

将RAW264.7细胞接种于6 cm培养皿中，加入完全培养液(含10%的胎牛血清及1%的双抗)，置入培养箱内培养(温度为37 ℃，CO2的体积分数为5%)。24小时待细胞贴壁后，加入50ng/mL的RANKL诱导因子。隔日换液1次，并保持RANKL的终浓度为50 ng/mL。每天在倒置相差显微镜下观察细胞的生长及分化情况。培养6天后做TRAP染色鉴定。按照TRAP染色试剂盒配置固定液和染色液。PBS洗1次，加固定液固定30 s，用去离子水彻底冲洗，再加TRAP染色液，置入37 ℃恒温箱避光孵育1 h，在倒置显微镜下观察并拍片。

1.3 实验分组

细胞分为对照组，TNF-α干预组和TNF-α抗体干预组。均用50ng/mL的RANKL诱导8天，其中TNF-α干预组在RANKL诱导6天后分别用低浓度(20ng/mL)、中浓度(50ng/mL)、高浓度(80ng/mL)的TNF-α干预48 h；TNF-α抗体干预组在RANKL诱导6天后分别用低浓度(20ng/mL)、中浓度(50ng/mL)、高浓度(80ng/mL)的TNF-α抗体干预48 h。

1.4 V-ATP酶基因和蛋白表达检测

实时荧光定量聚合酶链反应(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR)检测mRNA表达：Trizol提取总RNA，逆转录合成cDNA，逆转录设定的反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5s，4 ℃结束。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行实时检测，所用引物见表1。实时荧光定量PCR采用20 μL反应体系，包含前后引物各0.8 μL，10 μL SYBR®Premix Ex Taq II，0.4 μL ROX Reference Dye II，6 μL 无酶水与2 μL的cDNA。反应条件为：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 5s，60 ℃ 34 s 四十个循环。采用2-ΔΔCt法分析结果。

表 1 real-time PCR所用目的基因及引物Table 1 Primers of genes used in real-time PCR

Western blot检测蛋白质表达：用RIPA缓冲液提取破骨细胞的总蛋白，煮沸变性10分钟，进行凝胶电泳后转膜。然后与V-ATP酶兔抗鼠单克隆一抗4 ℃孵育过夜，GAPDH作为内参。羊抗兔IgG二抗孵育1 h。用Image J分析软件检测膜上每个条带的相对灰度值，测出各组蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 破骨细胞检测

接种24 h后，细胞开始逐渐贴壁，体积较小，均匀一致。在50ng/mL的RANKL的诱导下，6天后可见很多体积较大的多核细胞，呈圆形、梭形或不规则形状。TRAP染色呈阳性(图1)，细胞内含有多个细胞核，细胞质内可见大小不等的空泡。

图1 倒置相差显微镜下破骨细胞TRAP染色× 40Fig.1 Inverted phase contrast microscopic appearance of some typical rat osteoclast cells stained with TRAP (×40)

2.2 real-time PCR检测V-ATP酶mRNA的表达

破骨细胞分别与TNF-α及TNF-α抗体经过48 h共培养后，对照组、不同浓度TNF-α干预组及不同浓度TNF-α抗体干预组V-ATP酶的mRNA相对表达量见图2、图3。低、中、高浓度TNF-α干预组V-ATP酶的mRNA 表达量显著高于对照组(P<0.000 1)；低、中、高浓度TNF-α抗体干预组V-ATP酶的mRNA表达量显著低于对照组(P<0.000 1)。该结果提示TNF-α能够显著提高V-ATP酶的mRNA表达；TNF-α抗体能够显著降低V-ATP酶的mRNA表达。

图2 不同浓度TNF-α对V-ATP酶mRNA表达量的影响 (***P<0.000 1)Fig.2 Effect of different concentrations of TNF-alpha on the mRNA expression of V-ATPase

图3 不同浓度TNF-α抗体对V-ATP酶mRNA表达量的影响 (***P<0.000 1)Fig.3 Effect of different concentrations of TNF-alpha antibody on the mRNA expression of V-ATPase

2.3 Western-blot检测V-ATP酶蛋白的表达

破骨细胞分别与TNF-α及TNF-α抗体经过48 h共培养后，对照组、不同浓度TNF-α干预组及不同浓度TNF-α抗体干预组V-ATP酶的蛋白表达见图4、图5。TNF-α干预组V-ATP酶蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05)；TNF-α抗体干预组V-ATP酶的蛋白表达量明显低于对照组(P<0.05)。该结果提示TNF-α能够显著提高V-ATP酶的蛋白表达；TNF-α抗体能够显著抑制V-ATP酶的蛋白表达。

图4 不同浓度TNF-α对破骨细胞V-ATP酶蛋白表达量的影响Fig.4 Effect of different concentrations of TNF-alpha on the protein expression of V-ATPase

图5 不同浓度TNF-α抗体对破骨细胞V-ATP酶蛋白表达量的影响Fig.5 Effect of different concentrations of TNF-alpha antibody on the protein expression of V-ATPase

3 讨论

TNF-α是参与骨骼重塑的几种炎性细胞因子之一，它可以由正常的破骨细胞合成，主要作用是通过促进破骨细胞形成和抑制成骨细胞的功能而维持骨代谢的稳态[5]。TNF-α作为TNF 家族重要成员之一，可以刺激成骨细胞产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL6 等因子，诱导破骨细胞前体细胞分化为破骨细胞。也可以影响成骨细胞骨保护素(OPG)和RANKL的基因表达，从而调控破骨细胞的分化和活化[6]。研究表明，TNF-α不仅可以促进巨噬细胞或骨髓基质干细胞分化为破骨细胞，而且也可以提高破骨细胞的骨吸收活性[4]。

V-ATP酶是一种高度表达于破骨细胞膜上的特殊蛋白质，对控制细胞内的pH值的生理过程起着重要的作用，所以，其表达量对破骨细胞性骨吸收起着至关重要的作用[2,3]。V-ATP酶的核心结构由V1和V0两个不同的结构域及辅助亚基AC45和M8-9组成[7]。V1部分位于细胞质内，是一个570 ku的复杂结构域，由(A，B， C，D，E，F，G和H)8个不同的亚基构成，主要负责ATP的水解[8,9]。V0部分则位于跨膜区，是一个260 ku的复合体，由(a、d、e、c、c′、c″)6个不同的亚基组成，主要负责质子的转移[10]。在骨吸收的过程中，破骨细胞先贴附于骨表面，形成相对隔绝的细胞外骨吸收微环境，然后在酸性条件下溶解骨矿物质，继而降解骨基质成分[11]。研究发现，V-ATP酶以高密度在特定的细胞膜中表达，如肾闰细胞和破骨细胞等，它们在尿液酸化、破骨细胞的骨吸收中发挥着重要的作用[12]。破骨细胞分泌氢离子溶解羟基磷灰石晶体是骨骼脱钙的重要环节，其中，破骨细胞膜上的V-ATP酶参与氢离子分泌这一关键生理过程[7,13]。研究表明，V-ATP酶缺陷是患骨硬化病的常见原因[14]。本研究观察TNF-α对破骨细胞上V-ATP酶表达量的影响，可以了解TNF-α对提高破骨细胞骨吸收活性的机制。

破骨细胞作为终末细胞不能增殖和传代，以往获得破骨细胞的方法是提取鼠骨髓基质干细胞，然后诱导分化得到破骨细胞，这种方法难以获取大量高纯度破骨细胞。故本实验选用诱导破骨细胞前体细胞RAW264.7向破骨细胞分化。结果显示，50 ng/mLRANKL诱导RAW264.7细胞，6天后可获得大量成熟的破骨细胞，且TRAP染色呈阳性。

V-ATP酶在破骨细胞中表达量的增加可导致破骨细胞骨吸收活性的提高。本研究表明不同浓度的TNF-α作用于破骨细胞后，低、中、高浓度组破骨细胞上V-ATP酶mRNA的表达量显著高于对照组，且呈一定的剂量依赖性；同时，TNF-α干预组破骨细胞上V-ATP酶的蛋白表达量也显著高于对照组。此外，本研究还用不同浓度TNF-α抗体来干预破骨细胞，观察破骨细胞上V-ATP酶mRNA和蛋白的表达，结果表明TNF-α抗体可抑制破骨细胞上V-ATP酶mRNA和蛋白的表达，且呈一定的剂量依赖性。由此推测TNF-α作为一个炎症递质参与骨吸收的过程中，除了促进破骨细胞形成以外，其可能还通过增加破骨细胞上V-ATP酶的表达，从而增强破骨细胞的骨吸收活性。