贝伐单抗联合多西环素治疗胶质瘤的疗效与机制研究*

黄培成 程小耕 杨强 毕敬涛 曹姗姗

(1.绵阳市中心医院药学部，四川 绵阳 621000；2.北京积水潭医院，北京 100035；3.北京出入境检验检疫局，北京 100026)

胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤，其肿瘤进展快且复发率高，目前国际上对胶质瘤的治疗技术手段和方案的研究不断取得进展，但胶质瘤患者的生存期仍不容乐观[1-3]。近年来，肿瘤的分子靶向治疗逐渐成为研究热点，而血管内皮生长因子被认为是脑胶质瘤治疗的重要靶点[4-5]。

目前以促血管生成信号通路为靶点的治疗方案已应用于多种肿瘤的治疗，针对VEGF (Vascular endothslia growth factor)信号通路开发的多种抗血管生成抑制剂已见于临床治疗或临床试验研究中[6-7]。贝伐单抗是重组的人源化单克隆抗体，能抑制VEGF活性，使其肿瘤组织停止生长从而发挥抗瘤作用，是首个被FDA批准可用于临床治疗的抗肿瘤血管生成药物[7-9]。但单药治疗复发性胶质瘤，其疾病生存率仍没有较大改善，利用胶质瘤原代细胞，联合用药进行处理，对细胞的增殖，迁移及侵袭能力差异的检测，探讨贝伐单抗联合多西环素对胶质瘤治疗的作用及初步机制，为临床治疗提供有力的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 胶质瘤病人术后组织分离培养而得的原代细胞。

1.1.2 裸鼠 购自四川大学实验动物中心。

1.1.3 试剂 DMEM、FBS均购自于GIBCO公司；胰蛋白酶购自碧云天公司；贝伐单抗购自于罗氏公司；多西环素购自大连Melonepharma公司；MTS购自贝博；结晶紫、中性树胶购自索莱宝； CD34抗体和Ki67抗体均购自北京中衫金桥；山羊血清封闭液和山羊抗鼠二抗均购自福州迈新生物技术开发有限公司；苏木素及福尔马林组织固定液购自索莱宝生物技术有限公司。

1.1.4 仪器 细胞培养箱购自美国Thermo公司；倒置相差显微镜购自日本Nikon公司；生物安全柜购自苏净公司；高压锅及微波炉购自中国Galanz公司；miniQ去离子水仪购自美国Millipore公司。

1.1.5 贝伐单抗的配制 向100 mg/4 ml的贝伐单抗溶液中加入46 ml PBS稀释，其终浓度为2 mg/ml，分装于1.5 ml离心管中，4℃保存。其体外细胞的实际治疗浓度为2 μg/ml，体内裸鼠的实际治疗浓度为15 mg/kg。

1.1.6 多西环素的配制 称取25 g贝伐单抗粉末，用250 ml无菌水溶解，分装，-20 ℃避光保存。使用前，常温避光溶解；按照1:50稀释至小鼠清洁饮用水中(含1%的蔗糖水溶液)，水瓶用锡箔纸包住避光，每3天换液一次。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 胶质瘤原代细胞分离培养方法：取术后新鲜的胶质瘤组织，用眼科剪剪去坏死区域，PBS洗3次，之后用眼科剪剪碎组织，置于15 mL离心管中，加1 mg/mL的I、IV型胶原酶各3 mL，离心管置于37℃摇床中，220 rpm/min摇2 h，之后将组织裂解液依次过100 μm、40 μm的细胞筛网，将过滤后的细胞悬液1000 rpm，离心5 min，弃净上清，将细胞用含10% FBS的高糖DMEM培养基置于5% CO2、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞长至第三代后，取对数生长期的细胞用于后续的体内体外实验。

1.2.2 细胞MTS检测 细胞至对数生长期时，用胰蛋白酶消化细胞并计数。使其每孔的细胞数量为2000个，每孔100 μl。每组5个复孔，共3组，分别为生理盐水组、贝伐单抗组、贝伐单抗联合多西环素组，各组每2天换1次液，贝伐单抗与贝伐单抗每孔加药浓度均按2 μg/mL计算；共5行，每1行为1个检测时间点，在每个对应的时间点加入10 μl MTS，培养2 h，测OD 490。

1.2.3 平板克隆形成 根据计数的浓度铺6 cm皿，使其细胞数量为500 个/皿，贝伐单抗与多西环素每孔加药浓度均按2 μg/mL计算，各组每2天换一次液，共培养14 天。弃去培养基，PBS洗3次，用75%乙醇固定15 min，PBS洗3次，加入结晶紫染30 min，流水清洗干净后，室温晾干，拍照观察。

1.2.4 划痕实验 根据计数的浓度铺6cm皿，使其细胞数量为4×106个/皿，按分组加药，贝伐单抗与多西环素每皿加药浓度均按2 μg/mL计算，待细胞过夜培养长满后做划痕，分别在0、24、48小时拍照观察。

1.2.5 Transwell侵袭实验 根据计数的浓度将细胞铺在带胶的小室中，加药浓度均按2 μg/mL计算，加在小室上层内，上层内用无血清DMEM，下层中加入含10% FBS的DMEM，4%多聚甲醛固定后，结晶紫染色5 min，自来水清洗终止反应，显微镜下观察小室下层侵袭细胞并计数。

1.2.6 裸鼠成瘤实验 购买4～6周龄雄性裸鼠，于小鼠皮下注射200×104个/200 μl原代细胞。于接种15天后开始治疗，一组以生理盐水作为对照，一组在腹腔注射贝伐单抗，贝伐单抗按裸鼠体重15 mg/kg进行注射，每2天注射1次贝伐单抗；第三组腹腔注射贝伐单抗的同时在饮水中加入多西环素，多西环素按终浓度20 mg/mL稀释于饮水中，每3天换1次水，贝伐单抗浓度同前；各组均治疗42天。与此同时，于接种胶质瘤原代细胞后第7天开始测量移植瘤大小，每隔1周记录1次。

1.2.7 移植瘤免疫组化染色 待裸鼠肿瘤长至42天，取出肿瘤石蜡包埋后。烤片脱蜡，经过一系列修复，10%山羊血清封闭，分别加CD34及Ki67抗体，4℃孵育过夜后加山羊抗鼠二抗，最后用DAB显色，用苏木素复染细胞核，经脱水和透明后，封片并拍照观察。

1.3 统计学分析 采用SPSS软件进行计数资料χ2检验，组间差异采用t检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组抑制细胞增殖比较 MTS结果显示，与生理盐水组相比较，贝伐单抗组的增殖能力明显减弱(P<0.05)，而贝伐单抗联合多西环素组的抑制增殖能力更为明显，较贝伐单抗组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 MTS检测细胞增殖Figure 1 MTS detects cell proliferation注：与生理盐水组比较，①P<0.05，②P<0.01

2.2 3组抑制细胞平板克隆形成比较 克隆形成实验结果显示加贝伐单抗单药处理之后，与生理盐水组比较细胞的克隆形成能力减弱，差异有统计学意义(P<0.05)，贝伐单抗联合多西环素处理之后，细胞的克隆形成能力减弱更显著，较贝伐单抗组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，这与MTS的结果具有一致性，见图2 A、B。

2.3 3组抑制CD34、Ki67表达比较 取出的裸鼠移植瘤，进行免疫组织化学染色，观察CD34和Ki67的

表达情况，与生理盐水组相比较，贝伐单抗单药治疗后，移植瘤的CD34表达明显下降，且增殖指标Ki67表达也降低，说明血管密度降低；经贝伐单抗联合多西环素治疗后，CD34和Ki67表达信号几乎很难发现，这表明血管密度和增殖指标降低更明显，见图3。

图2 平板克隆形成定性染色和定量分析

Figure2PlateCloneFormationQualitativeDyeingandQuantitativeAnalysis

注：A.定性染色;B.定量分析;与生理盐水组比较，①P<0.05，②P<0.01

2.4 3组抑制细胞侵袭能力比较 Transwell侵袭结果表明，经贝伐单抗处理后的细胞比生理盐水组的细胞侵袭能力减弱将近40%(P<0.05)，而贝伐单抗联合多西环素进行处理，细胞侵袭能力比单加贝伐单抗减弱趋势更明显，其抑制能力高达80%，较贝伐单抗组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4 A、B。

图3 免疫组化染色Figure 3 Immunohistochemical staining注：移植瘤做免疫组织化学染色，黄色为标志物信号

2.5 3组抑制裸鼠皮下成瘤比较 结果显示，经贝伐单抗治疗后裸鼠的移植瘤相对于生理盐水组有所减小(P<0.05)，而经贝伐单抗跟多西环素联合用药后，移植瘤更小，治疗效果更佳(P<0.01)，见图5 。

2.6 3组抑制细胞迁移能力比较 细胞迁移实验结果显示，与生理盐水组比较，加贝伐单抗单药之后胶质瘤细胞的迁移能力减弱(P<0.05)，贝伐单抗联合多西环素处理的细胞迁移能力减弱更明显，较贝伐单抗组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见图6A、B。

3 讨论

恶性脑胶质瘤目前的标准治疗方案是最大程度的手术切除，但手术后残存的肿瘤细胞导致肿瘤复发，其预后效果差[10]。近年来，抑制肿瘤新生血管内皮细胞生成从而阻断供血，进而导致肿瘤细胞坏死，已成为肿瘤治疗的一个重要策略[11]。

图4细胞侵袭定性染色和相对定量分析
Figure4Cellinvasionqualitativestainingandrelativequantification

注：A.细胞侵袭定性染色;B.相对定量分析;与生理盐水组比较，①P<0.05，②P<0.01；与贝伐单抗组比较，③P<0.05

图5 移植瘤大小、重量、生长曲线Figure 5 Transplanted tumor size , xenograft weight and xenograft tumor growth curve

注：A.移植瘤大小；B.移植瘤重量;C.移植瘤生长曲线；与生理盐水组比较，①P<0.05，②P<0.01；与生理盐水组比较，③P<0.05，④P<0.01

图6 细胞迁移和创伤愈合率Figure 6 Cell migration and wound healing rate

注：A.细胞迁移创伤;B.创伤愈合率;迁移24h时，与生理盐水组比较，①P<0.05，②P<0.01；创伤迁移48h时，与生理盐水组比较，③P<0.05，④P<0.01

贝伐单抗能特异性的结合VEGF，抑制肿瘤新生血管形成，进而控制肿瘤生长[12-13]。本研究提示贝伐单抗能抑制人胶质瘤原代细胞增殖、迁移和侵袭能力，并发现其可影响CD34和Ki67的表达来抑制裸鼠皮下成瘤能力。2012年贝伐单抗被NCCN指南推荐单药或与其它细胞毒性药物联合用于治疗复发恶性脑胶质瘤，但是目前还没有公认的最佳药物联合方案[14-16]。因此对于贝伐单抗能否提高患者的远期生存还存有争议。血管生成的相关因子除了VEGF外，还与基质金属蛋白酶(MMPs)密切相关[17]。多西环素是四环类抗菌药物，同时也是非特异性MMPs抑制剂[18-19]。

本研究利用胶质瘤原代细胞为实验对象，对细胞进行生理盐水、贝伐单抗和贝伐单抗联合多西环素处理，其结果显示贝伐单抗联合多西环素药物处理的细胞明显比单独贝伐单抗加药处理的抑制能力强，不仅抑制细胞增殖，还抑制细胞的迁移能力和侵袭能力，使其药物作用具有一种叠加效果。贝伐单抗短期治疗可抑制肿瘤生长，但随着时间延长，其作用减弱，若联合多西环素，可改善肿瘤细胞环境，调节MMP2的翻译后活性，两者联合使用大大增强了对肿瘤生长的抑制能力。为观察药物在体内的抑制作用，本实验构建胶质瘤皮下裸鼠成瘤模型，贝伐单抗可抑制裸鼠成瘤的生长，其抑制率约为30%，此研究结果与之前相关报道具有一致性[20]，另外，本研究发现贝伐单抗联合多西环素处理后其裸鼠皮下肿瘤抑制率高达65.5%，可见靶向血管内皮因子结合靶向基质金属蛋白酶的双向药物，大大提高其影响功能。通过进一步分析，发现贝伐单抗联合多西环素使CD34和Ki67的表达显著下降，因此认为经过联合治疗后的移植瘤血管密度降低且增殖能力减弱可能是其抑制裸鼠皮下成瘤能力的主要原因。

4 结论

本研究结果显示，贝伐单抗联合多西环素通过抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力，药物产生叠加效应显著的增强抗肿瘤作用，可减少肿瘤新生血管的形成，从而抑制胶质瘤的生长、重量和体积，为临床治疗胶质瘤提供理论支持。