增生性糖尿病视网膜病变的生物信息与不同海拔患者相关性研究*

宋康 姚勇利 梁宏 徐启玉

(1.青海省人民医院内分泌科,青海 西宁 810001 ；2.青海大学医学院基础医学部，青海 西宁 810001；3.西北农林科技大学生命科学学院，陕西 咸阳 712100)

2型糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是由多种因素综合作用引起的一种代谢性疾病[1]。增生性糖尿病性视网膜病变 (Proliferative diabetic retinopathy, PDR)是糖尿病的慢性并发症之一，包括新生血管的形成，玻璃体积血或视网膜前出血[2]。近年来，青海省增生性糖尿病性视网膜病变的发病率逐年增长。视网膜新生血管如何形成及其作用机制目前尚不清楚。本文从NCBI(National Center for Biotechnology Information)的GEO(Gene Expression Ommibus)数据库中选取了2组RNA-Seq高通量测序数据并进行了相关生物信息学分析，同时结合青海省不同海拔地区临床资料拟对增生性糖尿病视网膜病变的发病机制进行研究，为临床诊断及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年9月～2016年9月青海省人民医院确诊为PDR的患者70例为PDR组，其中男性36例，平均年龄(57.32±5.28)岁，女性34例, 平均年龄(56.28±3.65)岁。并收集我院同时期健康体检中心患者65例为对照组，其中男性33例，平均年龄(55.86±4.31)岁，女性32例，平均年龄(55.03±3.05)岁。根据居住地海拔进行分组，分为西宁地区组(67例)和高海拔地区组(68例)。因西宁海拔为2295m,故设定西宁地区组(海拔≤2500m)，其余患者及健康人群均为居住地在2500～4500m米，故设定为高海拔地区组(2500

1.2 入选与排除标准 入选标准：①糖尿病诊断依据符合1999年世界卫生组织(WHO)诊断标准。②合并增生性糖尿病视网膜病变。③居住地海拔在≤4500m。排除标准：①合并糖尿病急性并发症。②有严重心脑血管并发症。③急、慢性感染者。④近期有创伤、外科手术者。⑤长期肝肾等脏器疾病及其他内分泌疾病。⑥妊娠期妇女。⑦非增生性糖尿病视网膜病变。⑧同时合并其他眼底病变。⑨居住地海拔>4500m。

1.3 方法

1.3.1 RNA-Seq高通量数据处理及差异基因筛选 从NCBI的GEO数据库下载相应数据集SRA格式的原始文件，随后使用NCBI的SRA Toolkit工具将其转化Fastq格式的读取序列，为简便进行后续分析，R语言下使用命令行相应组名代替序列文件名。随后利用FastQC软件工具对Fastq格式的原始RNA-Seq序列进行质量检测，并使用NextGen Sequence Workbench工具设置相应参数对低质量序列进行初步处理。处理完后，下载人类基因组序列文件，注释文件以及相应的INDEX文件，使用Tophat 和Bowtie工具进行比对，获得相应的序列比对文件信息。最后使用R语言的CummeRbund软件包进行差异基因表达分析，根据Trapnell 等(2012)[3]中所述方法对差异基因进行筛选，筛选参数设置为P<0.01，|Log2(Fold change)|>1。且Log2(Fold change)>1时基因表达上调，Log2(Fold change)<-1时基因表达下调。

1.3.2 差异基因蛋白相互作用网络分析 STRING(Protein-Protein Interaction Networks, STRING)是蛋白质研究领域最大的数据库之一，现包括2031个物种的9 600 000种蛋白质，收集相互作用蛋白数量达138000000，可以方便快捷的预测蛋白质之间的相互作用关系[4-7]。本文将所筛选差异基因导入到STRING(https://string-db.org/)在线工具中，选择物种为Homo Sapiens，并准确选择每个所识别基因的名称(本文中STRING共识别出85个基因)，对所识别差异基因进行蛋白相互作用分析，找出关键节点蛋白。

1.3.3 IGF基因的生物信息学分析 本文对筛选的IGF基因进行了初步生物信息学分析：利用ExPasy的Translate tool[8-12]将其基因序列翻译为蛋白质序列，利用3djigsaw将翻译的蛋白质序列提交到PDB(Protein DataBank)数据库中，并使用RasMol(http://www.openrasmol.org/)工具构建该蛋白质的三维立体结构。

1.3.4 实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR) 对ACSL5、IGF和CPS1基因的定量分析

1.3.4.1 总RNA提取及cDNA模板制备 按TRIZOL试剂说明书提取总RNA，抽取外周血，4℃ 离心，4000 g，10 min。室温干燥RNA沉淀，适量RNase-free H2O 溶解RNA。按照试剂盒的说明书(Imprim-ⅡTM，Promega)进行RNA的逆转录。

1.3.4.2 SYBR GREEN法引物设计 通过分析，本文选取了ACSL5、IGF和CPS1三个基因作为增生性糖尿病视网膜病变并可能与海拔有关联的候选基因。通过NCBI查找并下载该基因的CDS区序列，由于每个基因具有不同的剪切体，而对不同剪切体使用MEGA 6进行同源序列比对后，对保守区利用Beacon Designer 7 软件设计SYBR GREEN法荧光定量PCR的引物，引物序列如下： ACSL5-Forward: CCGTCTTACCTCTTCTTGA, ACSL5-Reverse: CATACATAGTCTTGGCATCTG; IGF-Forward: TAGTGAGTCGGAGGAAGA, IGF-Reverse: GGTATCTGTGCTCTGAGA；CPS1-Forward: TTGATTGGTGTGCTGTCT, CPS1-Reverse: GCCTCCTGATGGTAGATG。

1.3.4.3 qRT-PCR程序 设复孔，在PCR仪上进行扩增反应： 94℃初始变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，重复该循环40个，最后用2-△△CT对结果进行分析。

2 结果

2.1 差异基因筛选及其GO富集和信号通路分析 本研究从NCBI的GEO数据集GSE94019中共筛选到差异表达基因621个，其中499个基因表达上调，122个基因表达下调，从数据集GSE60436中共筛选到差异表达基因736个，其中523个基因表达上调，213个基因表达下调，从这两个数据集中共同筛选出了差异基因97个，其中60个基因表达上调，37个基因表达下调，见表1。

表1 差异基因筛选Table1 The expressed differentially genes of GEO datasets

利用DAVID在线分析工具对差异基因进行了GO富集和KEGG信号通路分析，结果显示这些差异表达基因主要参与到细胞组成的组织或合成、生物调控、刺激反应、发育进程、代谢过程、免疫系统过程等生物学过程，信号转导活性、转运活性等分子功能，细胞凋亡信号通路、胰岛素/胰岛素样生长因子通路的蛋白激酶信号级联、炎症趋化因子和细胞因子的信号转导通路、PI3激酶通路、Ras通路、帕金森、亨廷顿病、丙酮酸代谢、5-羟色胺降解、TCA循环Fas信号通路等信号通路，见表2。

2.2 差异基因的蛋白相互作用网络分析 通过 STRING 10.5 在线工具对所筛选的差异基因进行蛋白质相互作用网络分析，蛋白互作网络图结果显示CPS1、ACSL5、VEGF、IGF、TGF、OTC、ANGPTL4、CTGF、PDK1与HMGCS2蛋白与其他蛋白存在比较明显的相互作用关系，为此蛋白质相互作用网络的中心节点，见图1。

表2差异基因的GO分析和KEGG信号通路分析

Table2GOtermsandKeggpathwaysofdifferentiallyexpressedgenes

生物学过程数目(个)P细胞组分合成细胞过程定位再生生物调控应激反应发育进程多细胞生物过程代谢过程免疫系统过程凋亡信号通路胰岛素/胰岛素样因子的蛋白激酶信号级联通过趋化因子和细胞因子介导炎症信号通路帕金森病亨廷顿病丙酮酸代谢5-羟色胺降解三羧酸循环FAS信号转导通路氨基丁酸降解赖氨酸生物合成白细胞介素信号通路整合素信号通路p53通路的反馈回路糖酵解精氨酸生物合成43581126446456143691111512111118. 64E-043. 32E-025. 14E-032. 24E-046. 74E-058. 30E-036. 26E-039. 03E-024. 37E-054. 64E-028.14E-052. 35E-034. 36E-033. 84E-035. 64E-022. 86E-033. 34E-046. 32E-035. 27E-024. 14E-022. 18E-048. 04E-025. 58E-023. 65E-034. 36E-022. 35E-03

图1差异基因蛋白相互作用网络分析

Figure1Protein-proteininteractionnetworkanalysisofthedifferentiallyexpressedgenes

2.3 正常人群和增生性糖尿病视网膜病变患者ACSL5、IGF和CPS1核酸水平的变化 西宁地区PDR患者与健康体检者比较，ACSL5、CPS1的水平下降，IGF的水平上升，差异有统计学意义(P<0.05)；高海拔地区(2500

表3 各种指标的mRNA水平的变化Table 3 Expression level of kinds of genes

注：与西宁健康对照组比，①P<0.05;与高海拔健康对照组比，②P<0.01;与西宁PDR组比，③P<0.05

2.4 两种蛋白三维结构分析

2.4.1 利用3djigsaw及Ramol对ACSL5蛋白的三维结构进行预测及构建，见图2。

图2 ACSL5蛋白质的三维结构预测Figure 2 The Three dimensional structure prediction of ACSL5 protein

2.4.2 利用3djigsaw及Ramol对IGF蛋白的三维结构进行预测及构建，见图3。

图3 IGF蛋白质的三维结构预测

Figure3TheThreedimensionalstructurepredictionofIGFprotein

3 讨论

实时荧光定量PCR对入选人群的样品中上述10个基因进行分析，发现只有ACSL5、IGF和CPS1 3种基因有明显的差异，其他7个基因的变化不是很显著，且文献检索发现，VEGF、OTC、TGF、ANGPTL4、HMGCS2、CTGF、PDK1研究较为广泛[13-14]。因此，本文着重探讨ACSL5、IGF和CPS1这3种基因与PDR的关系。

ACSL5基因，英文名为acyl-CoA synthetase long-chain family member 5，属长链脂酰 CoA合成酶家族的一员，该基因催化饱和脂肪酸合成长链脂酰 CoA的位置主要位于C:12～C:22间，在磷脂、胆固醇脂和甘油三酯等的合成和脂肪酸的氧化中起着关键作用[15]。ACSL5基因定位于人类第10号染色体区域，在子宫、骨骼肌、肾脏、眼底血管等组织中均有表达[16]。

IGF基因，英文名为insulin growth factor，是一种能够促生长作用的多肽分子，广泛存在于人体各种组织中，在细胞增殖、组织器官的生长及创伤后修复、胰岛素代谢、糖尿病视网膜病变等多种生理过程中均有表达, 参与了多项重要的生理或病理过程[16]。研究表明，增生性视网膜内皮细胞生长与IGF相关[17]。IGF在新生血管形成过程中，不仅能促进毛细血管内皮细胞的增殖与分化，还能促进凝血酶原激活物和氧自由基的释放，激活纤溶酶原，降解视网膜微血管的基底膜，使血管内皮细胞易于移动，导致新生血管形成出现增生性视网膜病变[18]。

CPS1基因编码氨基甲酰磷酸合成酶I(carbamoylphosphatesynthetase I)，该酶是一种线粒体基质酶，负责催化肝脏鸟氨酸循环的第一步(催化氨分子和二氧化碳形成氨甲酰磷酸)，在蛋白质和氮的代谢过程中起关键作用。

本研究通过对两组RNA-Seq高通量数据进行生物学信息学进行分析，共发现了97个差异基因，对这些差异基因进行GO富集分析、信号通路分析及蛋白相互网络作用分析后，共筛选出来了10个潜在的与PDR相关的基因，其中CPS1、ACSL5表达下调，VEGF、IGF、TGF、OTC、ANGPTL4、CTGF、PDK1与HMGCS2表达上调。 我们通过检测同一地区正常人群和PDR患者体内3种基因核酸的相对含量，发现ACSL5、IGF和CPS1 3种基因与PDR密切相关。首先，无论在西宁地区(≤2500m)，或者高海拔地区(2500

4 结论

ACSL5、IGF和CPS1 3种基因与PDR密切相关，提示ACSL5、CPS1和IGF可能成为高原地区增生性糖尿病视网膜病变的早期诊断指标。但具体机理及临床应用还需通过大量实验及临床病例深入探讨。