超高效液相串联质谱法测定豆粕中有机磷类药物残留量的研究

徐丽佳，张秀芹，刘 笑，苗 翠，郭国贤，律 瑶

（辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁 沈阳 110016）

有机磷是用于防治植物病虫害的使用最广泛的一类广谱、高效农药，多为磷酸酯类或硫代硫酸酯类。残留在兽药和饲料中的有机磷类农药被动物吸收富集后进入人类食物链，易被人体胃肠道吸收，已有医学报道证明这类化合物会引起人类基因突变等疾病，将严重影响人类健康。豆粕是棉籽粕、花生粕等12种动植物油粕饲料产品中产量最大，用途最广的一种，其作为畜牧业投入品应用于畜禽产品中的浓度高，所以豆粕中的农药残留，会对人体健康造成严重影响。农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪农和辛硫磷7种有机磷类农药在动物肌肉中的最高残留限量（MRL）为20～4000微克/公斤。目前，我国对豆粕中有机磷类农药残留限量并没有明确规定。现有的有机磷残留分析多采用气相色谱法及气相色谱—质谱法，方法的抗干扰能力较弱，前处理方法多采用凝胶渗透色谱法净化，处理过程繁琐，耗费溶剂。而关于豆粕中有机磷类农药残留的液相色谱-串联质谱检测，现有的方法、文献及标准均暂未查到。本文采用固相萃取净化方法，建立了同时测定豆粕中敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪农和辛硫磷7种有机磷农药残留的方法。该方法具有溶剂用量少、操作简便、灵敏度高、定性准确等优点。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

美国Waters公司ACQUITY UPLC-TQ Detector超高效液相串联质谱；Metler NE260分析天平；Therom Biofuge 离心机；JT baker ASEMD 60固相萃取装置；美国Organomation公司N-EVAP112氮气吹干仪；Stuart SA 8涡旋混合器；BUCHI Multivapor P-12旋转蒸发仪。Carb/ PSA (500mg/6cc)小柱，waters公司。

1.2 药品与试剂

对照品：敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪农、辛硫磷均购自上海市农药研究有限公司（100微克/毫升）。甲醇、甲酸、乙酸乙酯均为色谱纯，丙酮为分析纯，实验用水为一级水。

2 方法

2.1 混合对照品溶液配置

精密量取敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪农、辛硫磷对照品1.5毫升，置于10毫升容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为15微克/毫升的标准储备溶液，在-20℃下保存，在3个月内使用。分析时再配制成质量浓度为15、25、50、100、150、200纳克/毫升的系列混合标准工作液。

2.2 样品前处理方法

称取均质后的豆粕5克(精确到0.01克)于50毫升离心管内，加入10.0毫升乙酸乙酯，涡旋混匀，中速振荡提取5分钟，8000转/分钟离心5分钟，倾出上清液，重复提取1次，合并上清液；40℃旋转蒸发至干，向旋蒸管中加入5毫升丙酮，涡旋混合3分钟，作为备用液。

将Carb/PSA复合萃取柱用3毫升丙酮活化，取全部备用液过柱，控制流速为1毫升/分钟，收集流出液，用5毫升丙酮以相同流速洗脱柱子并收集，洗脱液于40℃氮气吹干，残余物中加入甲醇：0.2%甲酸水（50∶50）溶液1.0毫升，充分涡旋混匀后，过0.2微米微孔滤膜，液相色谱—质谱/质谱测定。

2.3 UPLC条件

色谱柱：B E H C18（100毫米×2.1毫米，1.7 米）；流动相：甲醇（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5.0分钟，50%A线性变化至90%A；5.0～5.1分钟，90%A线性变化至50%A；5.1～7.0分钟，维持50%A）；流速：0.3毫升/分钟；柱温：30℃；进样量：10微升。

2.4 串联质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压：3.5千伏；源温：120℃；雾化温度：350℃；锥孔气流速：50升/小时；雾化器流速：650升/小时。7种有机磷类药物的定量定性离子、锥孔电压和碰撞能量参数见表1。

3 结果与讨论

3.1 方法线性

分别精密量取适量的7种有机磷类药物混合标液，制得浓度为15、25、50、100、150、200纳克/毫升系列对照溶液，从中各取1.0毫升，分别溶解空白组织经提取、净化及浓缩后的残余物，摇匀，过0.2微米滤膜后作为基质匹配系列混合标准溶液，上机测定。按低浓度到高浓度的顺序依次进样，以对照溶液浓度为横坐标（X），定量离子对色谱峰面积为纵坐标（Y），求得回归方程，结果列于表2。可以看出，7种有机磷类药物在该浓度范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.990。

3.2 方法灵敏度

采用标准添加法，在匀浆后未处理的空白样品中添加7种有机磷类药物，按“2.2”项下方法处理和检测，依据色谱峰信噪比S/N＞3为方法检测限，S/N＞10为方法定量限，得出7种有机磷类药物的检测限为3微克/公斤，定量限为5微克/公斤。空白豆粕样品中添加14微克/公斤7种有机磷类药物的色谱图示于图1。

图1 空白豆粕样品中添加14微克/公斤7种有机磷类药物的色谱图

3.3 方法的回收率与样品检测结果

采用标准添加法，在匀浆后的未处理的空白样品中添加7.0、14.0、24.0微克/公斤3个不同浓度7种有机磷类药物，按“2.2”处理和检测，进行回收率试验，每批次进行6个样品的平行试验，得出7种有机磷类药物在3种添加浓度的回收率范围为67.6%～97.8%，批内RSD范围为0.5%～9.7%，批间RSD范围为3.4%～16.5%，均小于20%，详细结果见表3。同时，对来自辽宁省内不同厂家的30个饲料豆粕实际样品，按“2.2”处理和检测，测得的实测样品中7种有机磷类药物均为未检出。

表2 7种有机磷类药物校正曲线

表3 7种有机磷类药物在不同浓度加标回收率，相对标准偏差（RSD）

3.4 色谱条件的建立

考察了甲醇-0.2%甲酸水、乙腈-10毫摩乙酸铵溶液两种流动相对分析效果的影响。结果表明，采用甲醇-0.2%甲酸水为流动相时，有机磷农药的离子化效果较好，灵敏度高，采用梯度洗脱的方式，7种有机磷药物分离度较好。

3.5 质谱检测方法的建立

常用的质谱电离源有ESI源、APCI源和APPI等，摸索质谱条件时，以不同的锥孔电压进行正负离子扫描，发现7种有机磷农药均在正离子模式下响应较好。采用较高浓度的标准溶液，在正离子模式下进行母离子全扫描，确定各种药物的准分子离子，然后以准分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，获得二级质谱响应较强的子离子，最后以多反应监测模式进行采集。

3.6 样品前处理

有机磷农药是亲酯性化合物，不溶于水，易溶于有机溶剂。植物性产品主要用于二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈等极性较大的溶剂进行提取。本文比较了乙腈、乙酸乙酯和乙酸乙酯：正己烷（9∶1）三种溶剂的提取效果，见图2。结果表明，用乙酸乙酯的提取效果最好，提取液干净、杂质少。固相萃取方法具有省时、省溶剂、操作安全、重复性好的特点，常用的有机磷药物的固相萃取柱主要有活性炭萃取柱、C18反相固相萃取柱和Carb/NH2（碳黑/氨基）复合萃取柱。本文选取Carb/PSA复合萃取柱，净化效果好，回收率较高，能有效去除样品中的杂质干扰。因此，本文采用乙酸乙酯提取，提取液浓缩后，丙酮溶解，固相萃取净化。

图2 7种有机磷农药在不同提取液中提取回收率

4 结论

本法采用提取和固相萃取前处理技术，通过串联质谱法建立了7种有机磷农药残留量的测定和确证方法。本方法具有良好的线性关系、精密度、准确度、回收率和满意的定量限以及分离效果。目前我国暂无明确规定豆粕中有机磷类农药残留限度，通过对实际豆粕样品检测，得出该方法适用于检测豆粕样品中有机磷类农药的残留量，从而为控制豆粕中有机磷类农药残留提供有效检测方法。