枸杞多糖水提法提取条件的研究

张 君，段丽爽，常 南

（1.沈阳食品检验所，辽宁 沈阳 110136；2.沈阳产品质量监督检验院，辽宁 沈阳 110022）

枸杞又有红宝之称，是我国一种较为实用的传统的名贵中药材。具有养肝补肾、增阴润肺、益精明目等功效。它含有大量的蛋白质、维生素、多糖、矿物质及其它营养成分。现代医药及生理学认为枸杞中含有丰富的多糖，这些多糖具有很好药理活性，而且它也是一种免疫增强剂，具有抗衰老、抗氧化、抑制遗传性损伤、增强造血能力、治疗神经衰弱的作用等。目前已经明确其多糖是由阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖6种糖分聚合而成的酸性杂多糖与多肽或者蛋白质构成的复合多糖为主，同时包括中性杂多糖及葡聚糖等结合而成的复合多糖，是一种天然的大分子物质。近年以来，研究表明，枸杞多糖作为一种新的功能性因子拥有非常广阔的发展前景。特别是在多糖的药用保健、纯化以及提取等方面，海内外许多专家学者进行了大量的实验和研究，并提出了一些相关方面的处理工艺。目前国内外常用的关于枸杞多糖的提取方法一般有超声波提取法、微波浸提法、热水浸提法、碱液浸提法、超声-微波萃取法、酶法提取法以及超临界萃取法等。本实验采用热水浸提辅以苯酚硫酸法提取枸杞中的多糖成分，其特点在于：枸杞中的可溶性多糖在浓硫酸的作用下，可水解生成单糖，并且能够快速的脱水从而生成糠醛或羟甲基类衍生物。该种物质能和苯酚缩合形成一种橙红色的化合物，可在480纳米的波长下产生最大吸光值。实验中通过对料水比、pH值、提取温度、提取时间等4组因素的控制，研究其对枸杞中多糖提取量的影响，分析比较各因素的影响能力大小，在得到最适范围的前提下，优化条件从而得到最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宁夏枸杞（市售）；葡萄糖（分析纯，莱阳化工厂）；浓硫酸（分析纯，98%）；氢氧化钠（分析纯）；苯酚（分析纯，在配置时取蒸馏后的苯酚5克置于100毫升的容量瓶中加水定容）。

1.2 试验设备与器材

可见分光光度计：VIS-7200A，上海天美科学仪器有限公司；电子天平：AL204-IC，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；酸度计：PB-10，塞多利斯科学仪器（北京）有限公司；鼓风干燥箱：DHG-9145A，上海一恒科技有限公司；万能粉碎机：FW100，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 试验方法及设计

热水浸提法工艺流程为：枸杞→干燥→粉碎→形成粉末→过筛→装瓶→准确称量→溶解于锥形瓶中→调节pH值→加塞水浴加热→提取数小时→过滤→残渣洗涤→滤液与洗涤液合并。

1.3.1 枸杞多糖的提取步骤 在电子天平上精确的称取1.0克枸杞粉末若干份，将其分别置于200毫升的锥形瓶中，按照一定的料水比将蒸馏水加入锥形瓶中同时调节到相应的pH值。在水浴箱中加热到相应的温度并提取数小时，取出提取液过滤后，残渣洗涤2～3次。将洗涤液和滤液合并与50毫升的容量瓶中。

1.3.2 单因素试验的设计 确定提取过程中4个单因素分别为：提取温度、提取时间、料水比、pH值。

（1）固定料水比为1∶15，pH值为7，提取时间为1.5小时，分别置于35，45，55，65，75，85℃下提取，根据所得的吸光值计算出相应的多糖提取量，确定提取的最佳温度范围。

（2）固定料水比为1∶15，温度为55℃，pH值为7，分别处于0.5，1，1.5，2，2.5，3，4小时下提取相应的时间，测定吸光值进而得多糖提取量，确定提取时间的最佳范围。

（3）固定温度为55℃，浸提时间为1.5小时，p H值为7，料水比分别为1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，测定后通过标准方程得到多糖提取量，确定料水比的最佳范围。

（4）固定提取温度为55℃，料水比是1∶15，浸提时间1.5小时，分别调节p H值为4，5，6，7，8，9，10，同上述操作一样确定最佳pH值的范围。

1.3.3 正交试验的设计 在单因素确定的最佳范围下进行L9(34)试验，测得每组的吸光值大小，根据标准曲线方程得枸杞多糖的提取量，筛选出最佳的提取工艺。

1.4 枸杞中多糖提取量测定

1.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制 在天平中准确地称取20毫克标准葡萄糖溶于500毫升的容量瓶中定容，精确的吸取葡萄糖标准液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2毫升分别置于数个试管中。然后向各个试管中依次加入蒸馏水补至2毫升，并分别加入配置好的5%的苯酚溶液1.0毫升，振荡摇匀后迅速加入5毫升的浓硫酸，再次摇匀后于冷水中冷却10分钟。同时用2毫升的不含有葡萄糖的蒸馏水按上述顺序加入其他试剂做空白对照，在480纳米处测吸光值。

1.4.2 枸杞中多糖提取量测定过程 从50毫升的容量瓶中精确吸取1毫升的提取液于烧杯中，用蒸馏水将其稀释30倍后得到待测液。精确吸取待测的样品的溶液0.4毫升置于试管中，并加蒸馏水补至2毫升，然后再加入5%苯酚溶液1毫升，将试管振荡摇匀后迅速加入5毫升的浓硫酸，再次摇匀后置于冷水中冷却10分钟。同时用2毫升蒸馏水按上述顺序加入其他试剂作空白，在480纳米处测吸光值大小。

2 结果与分析

2.1 绘制标准曲线

标准曲线的方程为A=0.2889X+0.0206，R2=0.9906。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取温度对多糖提取量的影响 固定料水比为1∶15，pH值为7，浸提时间为1.5小时，分别在35，45，55，65，75，85℃下提取，按照1.4.2中方法进行测定，结果见图1。

图1 温度和多糖提取量的关系

由图1可知，在其他因素不变的情况下，枸杞多糖提取液中的糖分含量随着提取温度的不断升高，数值也呈现出上升的趋势。在55℃之前增加的幅度较为显著，之后增加的幅度不甚明显，甚至出现了下降的趋势。这种现象的产生则是由于温度的升高，加速了多糖的分解，使得活化的分子的数目增加，大大地促进了反应的进行，从而使得吸光值及多糖提取量增大，多糖的提取率得以提高。但根据相关的文献报道高温条件下可能会对多糖的活性和结构产生一定的影响。因此，在多糖提取过程中应该对温度加以控制，使其不能太高而被破坏成分。即最佳温度为55～75℃。

2.2.2 提取时间对多糖提取量的影响 固定料水比为1∶15，提取温度为55℃，pH值为7，分别在0.5，1，1.5，2，2.5，3，4小时下提取，按照1.4.2中的方法进行，结果见图2所示。

图2 时间和多糖提取量的关系

由图2可知，多糖提取量随着加热时间的延长，也在不断的增加。在2小时之前的一段时间内增加较为显著，之后逐渐趋于平缓甚至下降。这说明在适当的范围内，提取时间的增加使多糖的提取效果更加充分。并且这个过程给予了多糖足够的扩散时间，从而使得吸光值增加，多糖的提取量上升，提取率升高。但是随着时间的继续延长多糖提取量的变化幅度却在渐渐减小，而这种情况则间接地指出某一阶段之后，时间的延长已经无法进一步的促使多糖更加充分的扩散于溶液中。因此最佳提取时间应选择在1.5～2.5小时之间，以保证试验环境处于最适宜的条件下。

2.2.3 料水比对多糖提取量的影响 固定温度为55℃，提取时间为1.5小时，pH值为7，料水比分别采用1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，按照上述多糖测定的方法进行提取，结果见图3。

图3 料水比和多糖提取量的关系

从图3中可以看出，在提取时间，提取温度以及pH值一定的情况下，随着水量的不断增加，提取液中的多糖提取量也在持续的增大。这是由于溶剂的增多有利于枸杞中可溶性多糖成分的扩散，使多糖有足够的空间溶出进而进入提取液中，从而使其吸光值和多糖提取量增加，多糖提取率也随之上升。而且在料水比为1∶25之前，多糖的增加幅度比较明显，之后则趋于稳定。是因为一定程度的水量增加可以使提取效果明显升高，超过某一限定值后，除浓度被稀释外此条件也不再是主要的影响因素。故而在节能高效的原则下应将料水比控制在1∶20～1∶30之间，以使试验达到最佳的效果。

2.2.4 pH值对多糖提取量的影响 固定温度为55℃，料水比为1∶15，提取时间为1.5小时，分别在pH值为4，5，6，7，8，9，10下，按上面所述的方法对多糖进行提取，并绘制出图像，结果见图4。

图4 pH值和多糖提取量的关系

通过分析可知，在时间、温度、料水比固定的情况下，pH值对多糖提取量的影响也是较为明显的。随着pH值得不断增大，枸杞多糖提取液的糖分含量呈现上升之势。在pH值达到8之前，多糖的含量增加较为明显，之后渐渐趋于稳定，到达一定的程度后又逐渐减少。而这种现象是由于枸杞多糖中糖苷键的存在所造成的。糖苷键很容易被稀酸催化水解，而一般情况下多糖糖苷键对于稀碱是相对稳定的，因此酸性条件下非常不利于多糖成分的稳定。但是，枸杞多糖又是一种酸性的杂多糖，在高温条件下强碱对其成分的稳定性也会产生一定的影响。因而在对多糖提取工艺的研究中应将最佳pH值控制在8～10为宜。

2.3 枸杞多糖成分提取的多因素正交试验

在上述4个单因素实验的基础上，通过对其结果的分析，进而确定了每个因素的最佳提取范围。将试验中所得到的最佳提取范围进行正交处理，采用L9(34)正交试验法，按照提取温度、提取时间、料水比、pH值4个因素，对每个因素进行3个水平设计。通过所得数据选择出最优的提取工艺。

通过对表2中的正交试验结果极差分析可得出，各个因素对于枸杞多糖提取效果的影响力各不相同。其影响力的大小顺序表现为：提取时间＞料水比＞提取温度＞pH值。这说明提取时间对多糖成分提取效果的影响是最大的，是影响多糖提取量最主要的一个因素。其他因素对于提取效果也产生了非常大的影响，但它们的效果低于提取时间所产生的作用。并且表中的数据更加清晰的显示了枸杞多糖的最佳提取工艺为提取温度为55℃，提取时间为2小时，料水比为1∶25，pH值为9。此时的吸光值为0.936，多糖提取量为0.475克/克。

2.4 多糖提取的稳定性实验

任意选取一个样品试样如：温度为55℃，提取时间为1.5小时，料水比为1∶15，pH值为7，分别在15，25，35，45，55分钟条件下，进行不同时间内测定枸杞多糖提取量的试验。

通过对吸光度的测定可知，多糖提取液的吸光值在15分钟时就已经趋于稳定了，对应的多糖提取量也逐渐平稳，并且在之后的一段时间内没有发生明显的变化。因此在实际操作中可以选择在15分钟后的某一时间段开始测定液体的吸光值和多糖提取量。

表1 正交试验各因素水平表

表2 正交试验结果分析表

表3 多糖提取的稳定性试验

3 结论

尽管目前国内外关于多糖的提取工艺存在诸多形式，但究其原因都是为了确定特定方法下的最佳提取方案，使多糖的提取率达到最大。试验中运用热水浸提的方法，对影响枸杞多糖的提取因素进行了系统的研究，在对温度、提取时间、料水比、pH值4个因素进行单因素实验的基础上，确定了最适宜的提取范围：提取温度为55～75℃，提取时间为1.5～2.5小时，料水比为1∶20～1∶30，pH值为8～10。

在单因素试验之后又对上述4个因素进行正交试验，进而在正交试验的基础上得到不同因素的影响能力各有差异，从影响效果上可以看出它们的大小顺序为：提取时间＞料水比＞提取温度＞pH值。并且通过对吸光值和多糖提取量的分析可知最佳的提取工艺为：提取时间2小时，料水比为1∶25，提取温度55℃，pH值为9。在该条件下其吸光值为0.936，多糖提取量为0.475克/克。

此外，也对枸杞多糖提取的稳定性进行了试验，确定了15分钟后的一段时间内提取液的吸光值和多糖提取量无明显变化，这也为其他类似试验的研究提供了一个可供参考的依据。