氧化还原酶在多酶级联反应中的应用进展

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(浙江工业大学 生物工程学院,浙江 杭州 310014)

氧化还原酶是一类催化电子供体的电子转移到电子受体的酶的总称.根据电子供体的种类,氧化还原酶可分为22个亚类.因而,氧化还原酶可催化种类繁多的反应,而这些反应往往需要辅酶的参与.作为生物催化剂,氧化还原酶具有高度的化学选择性、区域选择性和立体选择性,所催化的反应具有条件温和、速率快、产率高和副产物少等优点,适用于制备手性化合物[1].

在酶催化的多步反应中,由第一种酶催化形成的中间体,自发进行进一步的反应直到形成稳定产物的过程,称之为级联反应.整个反应在同一容器内进行,至少有一种酶参与催化.在过去的几十年中,多酶级联反应已被大量开发并应用于有机合成领域,例如药物中间体的合成、生物能源的开发和化妆品成分的加工等[2-5].多酶级联反应有相对简单的双酶组合,也有高度复杂和专门化的多酶体系.近年来,通过多酶级联反应合成手性醇、胺和氨基酸已取得了显著的进展.一锅法多酶级联反应具有以下优点:缩短反应时间、降低产品回收过程的步骤和成本,改变可逆反应的平衡使其有利于产物的生成,减少不稳定中间产物的形成和积累等[6].因此,将多酶级联反应应用到氧化还原酶催化合成手性醇当中能够结合两者的优势,具有很高的应用价值.多酶级联反应可分为线性级联、正交级联、平行级联和循环级联四类[6-7].笔者主要介绍了氧化还原酶在不同多酶级联反应类型中的应用.

1 氧化还原酶与线性级联反应

单一底物通过一种或多种中间体将多步反应以一锅法的方式转化为单一产物的过程称为线性级联反应.线性级联反应可以省略中间产物的分离,避免中间体的积累,尤其是当中间产物不稳定时,级联反应使得反应过程更有效.D -泛解酸内酯(D -PL)是制备D -泛酸钙的重要手性中间体[8],氧化还原酶和线性级联反应相结合在不对称合成D -泛解酸内酯上取得了良好的催化效果.Si等[9]通过Rhodococcuserythropolis中的L-泛解酸内酯脱氢酶(LPLDH)催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯,中间产物酮基泛解酸内酯(KPL)会自发水解成酮基泛解酸(KPA),之后在酮基泛解酸还原酶(KPR)和葡萄糖脱氢酶的双酶作用下全部的酮基泛解酸被还原成D -泛解酸,D -泛解酸在酸性条件下最终闭环形成D -泛解酸内酯.在该级联反应体系中,当底物浓度为0.768 mol/L时,L-泛解酸内酯的转化率为91.9%,当浓度达到1.15 mol/L时,转化率可达80%,其合成路径为

另一个成功的例子是老黄酶(OYE)与羰基还原酶(CR)线性级联催化环己烯酮两步还原合成环己醇.Romano等[10]在酿酒酵母中共表达了老黄酶和羰基还原酶,首先由老黄酶对环己烯酮中的C=C双键进行反式氢化,随后羰基还原酶催化羰基还原生成环己醇,产物得率达到了95%以上,其两步还原过程为

2 氧化还原酶与正交级联反应

在正交级联中,底物转化为产物时通过偶联另一反应,从而实现辅酶/辅底物的再生或者进一步消除副产物.最经典的正交级联是羰基还原酶偶联脱氢酶从而实现辅酶再生,脱氢酶使NAD(P)+形成NAD(P)H,而NAD(P)H又在羰基还原酶催化的还原反应中变成NAD(P)+.Zhao等[11]利用来自Saccharomycescerevisiae的羰基还原酶(SceCPR1)和Exiguobacteriumsibiricum的葡萄糖脱氢酶(EsGDH)构建了双酶共表达载体用于催化酮基泛解酸内酯不对称合成D -泛解酸内酯.这两种酶均属于NADPH依赖的酶,通过添加辅底物葡萄糖实现了辅酶的有效再生;在该级联反应中,最终得率达91.6%,e.e.值达99.9%以上.羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶正交级联实现有效的辅酶循环为

甲酸脱氢酶是另一种氧化还原反应中构建辅酶循环的常用酶,它能够催化甲酸、甲酸铵等物质脱氢形成CO2,同时使辅酶NAD+还原成NADH.Liu等[12]利用来自Bacilluscereus的亮氨酸脱氢酶(BcLeuDH)和来自Candidaboidinii的突变型甲酸脱氢酶(CbFDHA10C)在大肠杆菌中构建了双酶共表达系统，用于从苯甲酰甲酸合成L-苯甘氨酸,并在此基础上提出了多酶调控表达的策略.通过共表达CbFDHA10C的1～4个拷贝并优化表达系统中BcLeuDH的RBS序列,大肠杆菌BL21/pETDuet-rbs4leudh-3fdhA10C中BcLeuDH与CbFDH活力的比例调节为2∶1.使用该调控策略得到的细胞对于苯甲酰甲酸的催化活力达到了28.4 mg/(L·min·g),是不进行表达调控的细胞的3.7倍.亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶正交级联实现辅酶循环路径为

正交级联并不是实现辅酶循环的唯一方式.事实上,在线性级联中通过氧化还原酶的巧妙组合也可实现辅酶循环.Müller等[13]构建了共表达P450单加氧酶和醇脱氢酶的全细胞线性级联反应体系,并应用于环辛烷二步氧化生成环辛酮.该体系为三酶共表达系统,单加氧酶P450 BM3 19A12NADH能够同时利用NADPH和NADH作为辅酶催化环辛烷生成环辛醇,而来自Lactobacillusbrevis的醇脱氢酶(Lb-ADH)和Rhodococcuserythropolis的醇脱氢酶(RE-ADH)的辅酶依赖性相反但都能催化环辛醇脱氢.因此,环辛烷二步氧化生成环辛酮的同时实现了辅酶循环,其路径为

3 氧化还原酶与平行级联反应

在级联反应中,有两种或多种底物通过不同的生物催化反应转化为两种或多种产物,不同的催化反应共用同一套辅酶或辅底物再生系统,这种多酶催化体系称之为平行级联反应.平行级联反应与正交级联反应具有相似之处,两者的差异在于前者的多个反应得到的都是目的产物[6].例如在氧化还原反应中,往往需要偶联一个葡萄糖脱氢酶,使辅酶再生得以进行.但其催化所得产物并不是目的产物而是副产物.Bisogno等[14]将外消旋醇的选择性氧化和2-氯苯乙酮的不对称还原过程相结合,同时反应获得两种单一构型的仲醇,反应过程只需要一种脱氢酶.此外,通过使用立体选择性相反的ADH(Prelog选择性的Rhodococcusruber中的ADH-A和反Prelog选择性的Lactobacillusbrevis中的LB-ADH),可以分别获得相反构型的醇,且e.e.值都保持在99%以上.外消旋醇的选择性氧化与2氯苯乙酮不对称还原相结合的平行级联反应过程为

4 氧化还原酶与循环级联反应

循环级联反应是指不同构型底物中的某一构型选择性地转化成中间体,然后转化成另一构型,以此不断改变同一化合物不同构型的构成比例.循环级联反应最常见的例子是胺、氨基酸、仲醇或α-羟基酸的去消旋化[7].在醇的去消旋中,通过将一种构型的醇氧化成酮,然后酮再被还原成另一构型的醇,这样循环不断消耗其中一种构型而另一种构型逐渐积累,理论产率可达100%.Li等[15]选择来自CandidaparapsilosisCCTCC M203011的立体特异性羰基还原酶(SCR1)和来自ZygosaccharomycesrouxiiATCC14462的酮还原酶(KRD)构建的(R,S)-1-苯基-1,2-乙二醇(PED)去消旋化的级联反应体系.研究者探究了两个酶的催化性质并对催化条件进行了优化,当SCR1/KRD活性比为1∶4,NADP+/NADPH摩尔比3∶1,在pH 7.0和30 ℃下反应8 h,产物(R)-PED的产率为91.62%,e.e.值达到95.5%.外消旋1-苯基-1,2-乙二醇的去消旋化过程为

Xue等[16]选择来自PseudomonasaeruginosaNUST中的FMN依赖型(S)-2-HADH催化(S)-羟基酸的脱氢,选择来自LeuconostocmesenteroidesCCTCC M 2016063的2-酮酸还原酶(2-KAR)催化酮酸还原成D -羟基酸,同时利用来自Exiguobacteriumsibiricum的葡萄糖脱氢酶(GDH)实现辅酶再生.研究者分别构建了重组质粒pET28b-HADH和pCDFDuet-KAR-GDH并共同导入大肠杆菌进行三酶共表达,利用该整细胞在35 ℃和pH 7.5下进行循环级联反应催化多种2-羟酸化合物的去消旋化,转化率高达98.5%.氧化还原酶催化2-羟基酸去消旋化的过程为

Köhler等[17]构建了一个由ATHase,L-氨基酸氧化酶(LAAO),D -选择性氨基酸氧化酶(DAAO)相结合的复杂的级联反应体系并用于从L-赖氨酸合成L-哌啶酸.LAAO催化L-赖氨酸得到潜手性物质经ATHase还原得到哌啶酸的两种构型,DAAO选择性氧化D -哌啶酸转化回潜手性物质,以此逐渐提高L-哌啶酸的对映体过量值.在优选的反应条件下,底物的转化率达到了90%,产物e.e.值达到了86%.利用循环级联反应从L-赖氨酸生产L-哌啶酸的过程为

5 结 论

诸多实例表明多酶级联反应已在生物催化和有机合成领域展现出了巨大的应用潜力.多酶级联反应通常以一锅法催化的方式进行,免去了中间产物的分离提取过程,可以改变反应平衡使其有利于产物的形成,提高能量和物质的利用率,降低成本.当中间产物为不稳定的化合物时,多酶级联反应尤其具有优势.此外,平行级联反应提供了同时生产两种手性化合物的可行方案,这将进一步提高生物催化的效率.多酶级联反应可分为线性级联、正交级联、平行级联和循环级联等基本类型.然而实际构建的多酶体系往往更为复杂,涉及不止一种级联设计策略.例如辅酶循环是氧化还原酶催化体系的核心技术问题之一,每一种级联反应都需要合适的辅酶循环解决方案.酶是多酶级联体系的核心要素,而复杂的多酶级联体系对其提出了更高的要求.氧化还原酶具有功能的多样性、来源的广泛性以及高度的专一性,它在级联反应中的应用将丰富多酶级联反应的设计并最终服务于化学品的高效合成.