Th1/Th2、Treg/Th17细胞平衡在慢性乙型肝炎发病机制中的作用

胡萍 王芳 周星

武汉市金银潭医院感染性疾病科（武汉 430000）

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）与肝硬化、肝细胞癌发生密切相关，严重影响人体健康，适应性免疫在CHB发病中起着重要作用[1]。在适应性免疫中，辅助性T细胞（helper T cell，Th）主要通过调节免疫应答和刺激B细胞产生抗体而发挥作用。最先被发现的两类辅助性T细胞分别为Th1细胞和Th2细胞。后继又发现了其他辅助性T细胞，包括Th17、调节性T细胞（regulatory cell，Treg）、Th22、Th9和滤泡辅助性T细胞（follic⁃ular helper T cell，Tfh）。各类细胞通过分泌不同的细胞因子，参与炎症、肿瘤及自身免疫反应等过程[2]。CHB的发病与乙型肝炎病毒（hepatitis B vi⁃rus，HBV）感染后所介导的免疫损伤和慢性炎症有关[3]。Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群变化在CHB中的作用备受关注，但在CHB中关于Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群失衡的研究尚少[4⁃5]。本研究通过检测CHB患者外周血中Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡及相关细胞因子的表达，探讨Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡在CHB炎症免疫中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2016年1月至2017年6月间，我院就诊的64例CHB患者为CHB组，其中男33例，女31例，年龄（38.9±10.2）岁。纳入标准：（1）满足《慢性乙型肝炎防治指南》[6]中CHB诊断标准；（2）排除其他病毒感染、免疫相关性疾病和使用免疫调节剂导致肝功能障碍者；（3）无心脑血管疾病；（4）对本研究知情同意，并签署同意书。选取同期66例健康体检者为对照组，即NC组，其中男35例，女31例，年龄（40.1±14.6）岁。两组性别、年龄差异均无统计学意义。本研究征得患者同意并经医院伦理委员会批准实施。

1.2 主要仪器与试剂恒温细胞培养箱购自美国Thermo公司，酶标仪购自美国BD公司，流式细胞仪购自美国BD公司，佛波脂、离子霉素、莫能霉素购自美国Sigma公司，RPMI1640培养液购自美国Gibco公司。一抗、二抗均购自美国BD公司。白细胞介素17（interleukin⁃17，IL⁃17）、白细胞介素23（interleukin⁃23，IL⁃23）、白细胞介素 4（interleu⁃kin⁃4，IL⁃4）、白细胞介素 10（interleukin⁃10，IL⁃10）、转化生长因子⁃β（transforming growth factor⁃β，TGF⁃β）、γ干扰素（Interferon⁃γ，INF⁃γ）ELISA试剂盒购自武汉博士德生物公司。

1.3 实验方法

1.3.1 Th1、Th2、Th17及Treg测定采用流式细胞仪检测：500 μL全血加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，混匀。每管分别加入佛波脂20 ng/mL、离子霉素1 mg/mL、莫能霉素10 ng/mL，再次混匀。放置于37℃5%CO2恒温细胞培养箱孵育4.5 h。孵育后混匀，取出血样每个流式管加入100 μL，共6管，每管加入3～4 mL溶血剂，颠倒混匀，放置8 min，溶解红细胞。离心洗涤1次。每管加入胞外抗体白细胞分化抗原4（cluster of dif⁃ferentiation4，CD4）、白细胞分化抗原 8（cluster of differentiation8，CD8），避光4℃孵育20 min，取出后PBS洗涤1次，加入破膜剂避光孵育20 min，取出后磷酸盐缓冲液（phosphate⁃buffered saline，PBS）洗涤1次，Th1、Th2、Th17、Treg检测流式管内分别加入INF⁃γ、IL⁃4、IL⁃17胞内抗体，避光孵育20 min，PBS洗涤 1次后加入 500 μL PBS后上机检测。

1.3.2 细胞因子检测IL⁃17、IL⁃23、TGF⁃β1、IL⁃4、INF⁃γ、IL⁃10细胞因子采用ELISA检测，收集外周静脉血5 mL，经2 500 r/min离心后收集血清，具体实验操作根据ELISA试剂盒说明书操作。

1.3.3 丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）的测定两组ALT、AST结果由本院检验科统一测定。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件行统计分析，计量资料以表示，计数资料以例（%）表示，计量资料两两比较采用独立样本t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组ALT、AST比较CHB组ALT高于NC组（P=0.031），CHB组 AST高于 NC组（P=0.026）。见表1。

表1 两组ALT、AST比较Tab.1 Compare of ALT，AST between two groups x ± s，g/L

2.2 两组Th1、Th2、Th17及Treg的比较外周血中Th1细胞占CD4+比例CHB组显著高于NC组（P=0.012），Th2细胞占CD4+比例CHB组显著低于NC组（P=0.021），Th17细胞占CD4+比例CHB组显著高于NC组（P=0.032），Treg细胞占CD4+比例CHB组显著低于NC组（P=0.027）；Th1/Th2、Th17/Treg细胞比例在CHB显著高于NC组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 两组IL⁃17、IL⁃23、TGF⁃β1、IL⁃4、INF⁃γ、IL⁃10的比较与NC组相比，CHB组患者外周血IL⁃4、IL⁃10浓度降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL⁃17、IL⁃23、TGF⁃β1及 INF⁃γ浓度增高（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

CHB发病机制目前尚不完全清楚，普遍认为其发病与宿主免疫调节紊乱导致的病理损害有关。当机体感染乙肝病毒时，细胞免疫启动，急性肝炎患者会产生强烈的、非特异性的细胞毒性T淋巴细胞和Th细胞反应，而CHB患者免疫反应较弱，甚至不能检测到特异T细胞反应，从而导致病毒感染持续存在。乙肝患者体内存在Thl/Th2细胞及其相关细胞因子的失衡，但是目前研究结论存在一定争议[7⁃12]。有研究[10]认为，CHB中Th2细胞表达显著增高，也有研究称CHB患者外周血中Th1及其所分泌的细胞因子IFN⁃γ较正常对照组并无显著改变[11]。而 FENG 等[12]研究结果认为CHB患者肝炎活动时Th1细胞占优势，而Th2细胞无论在CHB活动期与非活动期间差异均无统计学意义。本研究显示在CHB组中Th1占优势，而Th2相对减少，Th1/Th2平衡向Th1方向偏离。同时，Th1分泌的细胞因子IFN⁃γ，CHB组显著高于NC组，这也与Th1/Th2平衡偏移方向一致。既往研究发现肝移植后HBV复发患者肝内IFN⁃γ和TNF⁃α的产生与肝细胞坏死呈正相关。本研究和既往研究均证实Th1细胞产生的细胞因子与肝损伤相关，而Th2与对抗病毒感染相关，Th1细胞增强了细胞免疫作用，同时增加了肝脏的炎症反应[13]。

表2 两组Th1/Th2、Th17/Treg的表达变化Tab.2 The change of Th1/Th2，Th17/Treg between two groups±s

表2 两组Th1/Th2、Th17/Treg的表达变化Tab.2 The change of Th1/Th2，Th17/Treg between two groups±s

注：与NC组比较，aP＜0.05

组别CHB组NC组t值P值Th1（%）17.85±1.92a 12.25±1.23 23.429 0.012 Th2（%）1.39±0.37a 2.47±0.83 16.109 0.021 Th1/Th2 6.98±2.54a 4.26±1.74 11.056 0.029 Th17（%）2.36±1.09a 1.58±0.42 9.225 0.032 Treg（%）3.39±1.23a 5.58±1.96 13.493 0.027 Th17/Treg 0.98±0.46a 0.26±0.09 3.152 0.038

表3 两组IL⁃17、IL⁃23、TGF⁃β1、IL⁃4、INF⁃γ、IL⁃10蛋白表达Tab.3 The expression of IL⁃17，IL⁃23，TGF⁃β1，IL⁃4，INF⁃γ and IL⁃10 protein between two groups x ± s

Th17/Treg平衡失衡与CHB的疾病发展和缓解密切相关[14]，Th17细胞在HBV感染时起促炎作用，加重肝细胞损伤[15]。而Treg细胞主要存在于抑制炎症免疫应答过程中[16]，两者相互抑制共同作用。研究[17]发现，Th17与Treg细胞在慢性乙型病毒性肝炎不同疾病阶段存在免疫失衡，在免疫耐受阶段，Treg细胞发挥主要作用，在严重炎症活动阶段，Th17细胞发挥主要作用。本研究显示，在CHB患者外周血中Th17比例增高，Treg细胞比例降低，Th17/Treg平衡向Th17偏移，Th17释放的促炎细胞因子IL⁃17、IL⁃23增多，促使CHB患者肝细胞炎症加重，加重肝细胞损伤。同时CHB组的TGF⁃β1显著高于NC组，该结果是由于TGF⁃β1可能诱导初始T细胞向Th17分化，TGF⁃β1含量在CHB组高于NC组更能说明其可能在CHB中存在一个正向调控Th17表达的作用[18]。本研究结果与既往研究结果一致，可认为CHB患者中Th1/Th2、Th17/Treg比例失衡在CHB发病中起到重要作用。两个平衡偏移，引发其释放的细胞因子的改变，导致一系列细胞因子的网络反应。本研究还提示，在CHB组AST、ALT均显著高于NC组，提示Th1/Th2、Th17/Treg比例失衡与肝细胞损伤、肝功能下降直接相关。

综上，Th1/Th2、Th17/Treg比例失衡可能通过其所产生的细胞因子改变在CHB发病中发挥作用。