ESAT⁃6和CFP⁃10在感染性脊椎炎鉴别诊断中的作用

孙宇鹏 何少波 张春强 杜开利 郭培宇 赵润民

昆明医科大学第一附属医院骨科（昆明 650032）

脊椎炎（VO）是一种以特定病原微生物引起，累及椎体、椎间盘及椎体周围组织的感染性疾病，可由血液传播、相邻软组织感染扩散或脊柱外科手术中直接感染导致[1]，在发达国家年发病率为2.9～ 5.4/10万，其中年龄＜ 59岁占49.5%[2]。在我国，大部分脊椎炎的病例被诊断为脊柱结核感染，但仍存在较高的误诊率。结核感染T细胞试验（T⁃SPOT.TB）是近年应用于结核病临床诊断的重要方法，其使用的特异性抗原6 kD早期分泌靶向抗原（ESAT⁃6）和10 kD培养滤过蛋白（CFP⁃10）均不存在于卡介苗开放读码框中，因此不受卡介苗影响从而大大提高MTB感染的检出率，目前国内外许多研究证实T⁃SPOT.TB在诊断结核感染中具有较高的敏感度及特异度[3]。该方法以特异性抗原ESAT⁃6、CFP⁃10为刺激源，检测外周血中释放IFN⁃γ的特异性T细胞数量从而判断是否为MTB感染。结果由ESAT⁃6、CFP⁃10斑点计数决定，其中任意一个抗原斑点计数结果判定为阳性，则T⁃SPOT.TB结果为阳性。但在两种抗原刺激下，分泌IFN⁃γ的T细胞数量并不一样，便出现了两种抗原诊断结果不一致的情况。且T⁃SPOT.TB目前主要运用于肺结核领域，在脊柱结核病中的研究报道较少，且 T⁃SPOT.TB结果中ESAT⁃6、CFP⁃10在不同类型感染性脊椎炎鉴别诊断中的作用和效率相关研究较少。本研究通过脊椎炎患者外周血检测T⁃SPOT.TB结果中ESAT⁃6、CFP⁃10斑点计数进行分析，评价两种抗原在各种不同类型的脊椎炎鉴别诊断的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料资料来源于2014年7月至2017年7月就诊于我院脊柱外科，根据临床表现、一般实验室检查、感染相关指标检查及影像学检查，并最终通过血培养、病理组织学和脓液培养等手段明确病原学诊断患者共59例。见表1。

表1 59例脊椎炎患者一般资料及其T⁃SPOT.TB结果Tab.1 59 cases of patients with general information and their T⁃SPOT.TB results±s

表1 59例脊椎炎患者一般资料及其T⁃SPOT.TB结果Tab.1 59 cases of patients with general information and their T⁃SPOT.TB results±s

例数T⁃STOP.TB ESAT⁃6CFP⁃10阳性例数项目性别男女年龄35 24 14.62±32.08 34.12±32.00 33.14±55.17 28.41±40.80 19 18＜30 30～60≥60病变部位颈椎胸椎胸腰椎腰椎病种结核性脊椎炎布鲁氏菌性脊椎炎化脓性脊椎炎13 36 10 25.84±26.47 20.91±33.89 24.20±40.96 55.69±62.46 23.83±45.22 26.00±38.97 11 21 150 18 4 36 41.16±42.95 11.50±6.60 15.40±26.09 48.83±57.51 97.75±81.44 16.34±31.14 5 0 1 5 4 1 8 38 11 10 34.23±36.47 2.54±3.90 0.20±0.42 48.02±55.00 1.27±1.34 0.3±0.67 35 20

1.2 T⁃SPOT.TB检测方法及结果判定采用Ox⁃ford Immunotec公司T⁃SPOT.TB试剂盒，按照试剂盒说明书正确操作。阳性结果判定：空白对照斑点数≤5时，A抗原或B抗原斑点计数-空白对照孔斑点计数≥6；空白对照孔斑点计数6～10个时，A抗原（ESAT⁃6）或B抗原（CFP⁃10）孔斑点数≥2×空白对照孔斑点计数。如不符合上述标准且阳性质控对照孔正常时检测结果为阴性。空白对照孔斑点计数超过10个时、阳性质控对照孔斑点数小于20个时，检测结果被认为是“不确定”。T⁃SPOT.TB检测操作及结果判读由同一位医师完成。

1.3 统计学方法应用SPSS 23.0统计分析软件进行分析并绘制ROC曲线，计量资料用表示，计数资料组间比较采用χ2检验；一致性检验采用kappa分析，率的比较采用McNemer检验，P＜0.05为差异有统计学意义。使用GraphPad Prism 7.0绘制散点图并进行独立样本t检验。

2 结果

2.1 T⁃SPOT.TB结果38例结核性脊椎炎组患者中有35例阳性，21例非结核性脊椎炎组中2例结果为阳性，该2例患者最终明确诊断为布鲁氏菌性脊椎炎。T⁃SPOT.TB检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为92.10%、90.47%、94.59%、86.36%。T⁃SPOT.TB检测在结核性脊椎炎与非结核性脊椎炎阳性检出率差异有统计学意义（χ2=39.445，P=0.00）（表2）。

37例阳性结果中，仅ESAT⁃6阳性7例，仅CFP⁃10阳性3例，ESAT⁃6、CFP⁃10均阳性27例。绘制59例脊椎炎患者ESAT⁃6、CFP⁃10斑点计数散点图（图1），最终诊断为非结核脊椎炎病例2例阳性患者结果均为仅ESAT⁃6阳性（2例ESAT⁃6/CFP⁃10斑点数分别为11/1和9/1）。

表2 结核性脊柱炎与非结核性脊柱炎卡方检验Tab.2 The chi⁃square test results of TVO and non⁃TVO

对38例结核患者T⁃SPOT.TB结果中ESAT⁃6、CFP⁃10斑点计数进行独立样本t检验（图2），ESAT⁃6及CFP⁃10斑点计数在结核性脊椎炎患者中差异没有统计学意义（t=1.288，P=0.201）。

2.2 ROC曲线分析ESAT⁃6、CFP⁃10 对59例T⁃SPOT.TB结果ESAT⁃6、CFP⁃10斑点计数进行ROC曲线分析，ESAT⁃6、CFP⁃10曲线下面积分别为0.954、0.893。均取斑点计数≥6的最小坐标点（ESAT⁃6斑点计数 =6.5、CFP⁃10斑点计数 =7），ESAT⁃6敏感度与特异度分别为0.842、0.905（Youden index=0.747），CFP⁃10敏感度及特异度分别为0.763、1.000（Youden index=0.690）（图3）。

图1 59例脊椎炎患者ESAT⁃6、CFP⁃10斑点计数散点图Fig.1 The scatter diagram of ESAT⁃6 and CFP⁃10 spot counts by 59 cases of patients with VO

图2 结核性脊柱炎（n=38）ESAT⁃6、CFP⁃10斑点计数独立样本t检验Fig.2 The t⁃test results of ESAT⁃6 and CFP⁃10 by patients with TVO（n=38）

2.3 ESAT⁃6、CFP⁃10与病原学诊断结果一致性分析ESAT⁃6斑点计数McNemer结果显示与病原学诊断结果差异无统计学意义（P=0.289），诊断存在一致性（kappa=0.716，P′＜0.05），但病原学诊断结果一致性一般；CFP⁃10斑点计数McNemer结果显示与病原学诊断结果差异有统计学意义（P=0.008），且CFP⁃10诊断阳性率明显较差，为50.8%（30/59），诊断结果存在一致性（kappa=0.727，P′＜0.05），与病原学诊断结果一致性一般。ESAT⁃6与CFP⁃10进行kappa一致性分析，McNemer结果显示诊断情况一样（P=0.344），一致性一般（kappa=0.660，P＜0.05）（表3）。

3 讨论

各种类型的脊椎炎因为起病隐匿、临床症状不典型，早期诊断及鉴别诊断一直困扰着外科医生。尽管随着影像学及实验室检查的发展，但脊椎炎的早期诊断及鉴别诊断依然较为困难，极易误诊。脊椎炎可发生于各年龄段，呈现双峰分布，第一个高峰于20岁左右，第二个高峰出现在50～70岁，男女比例在为2∶1到5∶1之间[4]。疼痛为典型首发症状，其症状取决于病变位置，化脓性脊椎炎腰椎病变较为常见，其次是胸椎，颈椎较少见，90%结核性脊椎炎发生在胸和腰椎[5]。随着抗生素的普及和应用，脊椎炎的发病率正在上升。但随着卡介苗的接种及抗结核药物的使用，非特异性脊椎炎发病率明显高于结核性脊椎炎，且非特异性脊椎炎发病率超过结核性脊椎炎的3倍[6]。

图3 59例患者ESAT⁃6、CFP⁃10斑点计数ROC曲线分析Fig.3 The ROC curve analysis of ESAT⁃6 and CFP⁃10 spot counts

表3 ESAT⁃6、CFP⁃10与诊断结果一致性分析Tab.3 The consistency analysis of two antigens and consistency analysis

MRI敏感性及诊断正确率较高，典型结核性脊椎炎MRI中，病变椎体T1WI呈现均匀低信号，T2WI呈现不均匀高信号[8]。但大多数结核性脊椎炎患者的MRI为非典型表现。因此，临床表现及影像学检查较难区分不同类型的脊椎炎。而较为常用的实验室检查区分不同类型的脊椎炎敏感性较低、特异度较差，血、脓液培养检出率较低，活检为有创操作存在一定风险，因此灵敏度及特异度均较好的T⁃SPOT.TB引入我国后便迅速广泛应用于临床。

T⁃SPOT.TB在结核性脊椎炎中的敏感度、特异度报道不一，敏感度为77%～91%，特异度为77%～94%[9-14]。但研究资料多为结核性脊椎炎患者与健康患者，并不能体现T⁃SPOT.TB及结果中ESAT⁃6、CFP⁃10在脊椎炎鉴别诊断中应用价值。因此本研究中59例均为脊椎炎确诊患者，其敏感度及特异度为92.10%、90.47%。特异性与大多数研究结果一致，而敏感度稍高，可能与本组样本量较少有关。

从两种抗原斑点计数的散点图可知，ESAT⁃6分布较为集中，而CFP⁃10分布较为分散，未出现假阳性结果，提示了ESAT⁃6可能具有较高的敏感度，而CFP⁃10具有较高的特异度。因此，本研究进一步进行了ESAT⁃6及CFP⁃10斑点计数的ROC曲线分析，结果显示无论是 ESAT⁃6、CFP⁃10在ROC曲线分析中均具有较高的敏感度和特异度。因此，ESAT⁃6、CFP⁃10斑点计数结果可较为灵敏的鉴别结核及非结核性脊椎炎。但ESAT⁃6具有较高的灵敏度而CFP⁃10具有较高的特异度，这也与前面散点图分析结果相一致。同时也和2例假阳性患者T⁃SPOT.TB结果中CFP⁃10正确报告为真阴性而ESAT⁃6报告假阳性相符合。而在一致性分析中，ESAT⁃6与病原学诊断结果一致性较好，而CFP⁃10正确诊断阳性率稍差为50.8%，这可能与CFP⁃10具有较高的特异性有关。

尽管T⁃SPOT.TB敏感度及特异度较好，但仍存在一些缺点：（1）ESAT⁃6及 CFP⁃10主要存在于MTB复合群，但仍然存在于少数非结核分枝杆菌中，如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、转黄分枝杆菌和胃分枝杆菌，因此T⁃SPOT.TB并不能区分上面几种非结核分枝杆菌感染。（2）T⁃SPOT.TB并不能区分MTB携带者和MTB感染者[13]，且潜伏性结核感染斑点数有可能高于活动性结核，原因可能是：（1）潜伏性结核感染者免疫功能较好，少量的抗原刺激便激发了出活跃的保护性免疫；（2）活动性结核患者免疫功能低下，大量抗原刺激也不足以激起有效的细胞免疫。这也解释了本研究中有假阳性的结果出现，可能为MTB携带者的两例布鲁氏菌性脊椎炎患者导致敏感度较高的ESAT⁃6呈现假阳性结果。而相比之下敏感度较低、特异度较高的CFP⁃10在可能为携带者的两例布鲁氏菌性脊椎炎中没有出现假阳性结果，但也因此可能导致了CFP⁃10在本研究中呈现了假阴性率较高、与病原学诊断一致性较差且可信度相对较低的结果。

综上所述，ESAT⁃6具有较高的敏感度，且与病原学诊断结果情况一致性较好。并且具有较高的可信度应用于各种类型脊椎炎的鉴别诊断中。因本组病例较少，当ESAT⁃6斑点计数较高但CFP⁃10斑点计数较低时是否可以排除结核性脊椎炎，有待大数据ROC曲线进一步研究。