食管鳞癌组织MTA2、CD34的表达及其临床意义

高洁 王居平 朱名毅 卢露碧 李日著

1右江民族医学院病理生理学教研室（广西百色 533000）；2右江民族医学院附属医院心胸血管外科（广西百色 533000）

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其病死率位居我国恶性肿瘤患者的第四位，以鳞状细胞癌最为常见[1]，死因主要为肿瘤细胞的浸润和转移[2]。CD34是一种与新生血管内皮细胞增殖有关的蛋白，常作为肿瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的标志物[3]，而MVD则是肿瘤血管生成的重要标志。大量研究证实，血管生成在食管癌发生发展和浸润转移中发挥着极其重要的作用[4-5]。肿瘤转移相关基因2（metastasis⁃associated gene 2，MTA2）属于肿瘤转移相关基因的家族成员，其在胰腺癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤中表达均增强，且与肿瘤的浸润、转移密切相关[6-7]，但有关MTA2与食管癌血管生成相关性方面的研究，在国内外尚未见相关报道。本研究应用免疫组织化学法检测ESCC组织及正常食管组织中的MTA2和CD34的表达，探讨二者与ESCC患者临床病理参数之间的关系，为ESCC的转移机制及抗ESCC血管生成治疗提供理论及实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集百色市右江民族医学院附属医院2013年1月至2016年12月期间手术切除的80例患者标本蜡块，均为ESCC组织（观察组），同时选取胃镜检查活检标本中正常食管黏膜组织30例（对照组），患者术前未进行放化疗等针对肿瘤的特殊治疗。所有标本均由两位有经验的病理医师诊断。其中男46例，女34例，平均58岁。术后病理分期参照国际抗癌联盟的TNM分期标准[8]：Ⅰ+Ⅱ期42例，Ⅲ+Ⅳ期38例；分化程度：低分化28例，中分化32例，高分化20例；淋巴结转移：有38例，无42例；浸润程度：T1⁃T235例，T3⁃T445例。

1.2 主要试剂浓缩型山羊抗人抗体MTA2（Santa Cruz公司，USA）；抗山羊IgG聚合物（北京中杉金桥生物技术有限公司）；鼠抗人CD34单克隆抗体及免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化检测MTA2和CD34表达将选取好的石蜡切片脱蜡、水化、抗原修复，分别加入MTA2抗体（1∶500）、CD34抗体覆盖切片，滴加相应二抗，孵育后在切片上滴加新鲜配制的DAB显色试剂显色，经梯度乙醇脱水和二甲苯透明后，用中性树胶封片，阴性对照用PBS缓冲液。

1.3.2 结果判定MTA2阳性表达主要位于ESCC细胞核中，呈现棕黄色或棕褐色颗粒，每张切片在高倍镜（×40）下随机选取10个不同视野进行观察，使用双评分法进行结果判定[9]。（1）计数阳性细胞所占比例标准：5%以下记为0分，5%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，75%以上记为4分；（2）按细胞染色程度计分：无染色的记为0分，呈淡黄色记为1分，呈棕黄色记为2分，呈棕褐色记为3分。（1）和（2）乘积评分≤ 1分记为阴性（-），2～4分记为弱阳性（+），5～7分记为中等阳性（++），≥8分记为强阳性（+++）。CD34阳性表达者血管内皮细胞质呈棕色或棕黄色。MVD计数方法[8]：选取高倍镜视野（400倍）内最高微血管密度区3个，计数微血管的数目，取平均值后算出MVD值，结果以表示。结果判定均由两位以上高年资病理科医生审核。

1.4 统计学方法采用统计学软件SPSS 20.0对所有数据进行分析，MTA2和CD34表达的相关性采用Spearman等级相关系数，定量指标采用描述，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 ESCC和正常食管组织中MTA2和CD34的表达在ESCC组织中MTA2呈强阳性表达，主要表达于细胞核中，着色为棕褐色，阳性率为85%，且有较多的核分裂像（图1A），在正常食管组织中MTA2呈阴性表达（图1B）。ESCC组织中MVD值（41.7±1.8）显著高于正常食管组织的MVD值（12.3± 1.1）（P＜ 0.01），见表1。

图1 免疫组化检测MTA2在ESCC组织和正常食管黏膜组织中的表达（×40）Fig.1 Immunohistochemical staining analysis of MTA2 expression in ESCC tissues and normal esophageal mucosa tissues（× 40）

表1 ESCC组织和正常食管黏膜组织中MTA2、CD34的表达Tab.1 The expressions of MTA2 and CD34 in ESCC tissues and nomal esophageal mucosa tissues

2.2 MTA2、CD34表达与ESCC临床病理特征的关系本课题组前期研究结果表明，MTA2阳性表达与浸润深度、淋巴结是否转移及TNM分期密切相关[10]，且呈正相关，与分化程度呈负相关（r=-0.645，P＜0.05），而与患者的年龄、肿瘤大小无关（P＞0.05）。ESCC组织中MVD与组织大小、浸润深度、TNM分期、分化程度及淋巴结是否转移有关（P＜0.05），而与患者的年龄无关（P＞0.05）。见表2。

2.3 ESCC组织中MTA2表达与MVD的相关性Spearman等级相关性检验分析表明，在ESCC组织中，MTA2的阳性表达与MVD呈正相关（r=0.777，P＜ 0.01）。

表2 MTA2、CD34表达与ESCC患者临床病理参数的关系Tab.2 The relationship between MTA2 and CD34 expressions and clinical pathological parameters of esophageal squamous cell carcinoma patients

3 讨论

食管癌发病率、病死率正逐年升高，肿瘤细胞的浸润、转移是中晚期食管癌患者主要的死亡原因[2]。多项研究表明肿瘤细胞的浸润和转移需要形成大量的血管[3-4]，而新生的肿瘤血管可通过提供营养和转移的路径诱发原发肿瘤的浸润生长。因此，明确肿瘤血管在恶性肿瘤浸润转移过程中的作用机制，寻找抗肿瘤血管生成的治疗方法，已成为治疗恶性肿瘤的重要策略。

MTA2是具有核小体重塑活性的组蛋白去乙酰基酶（nucleosomeremodeling deacetylase，NuRD）的重要组成部分，主要通过抑制NuRD的活性来阻止基因转录，并通过调节细胞凋亡、细胞骨架和雌激素通路等途径促进恶性肿瘤的侵袭和转移[11]，是近年的研究热点。国内外研究显示，MTA1与多种恶性肿瘤血管生成密切相关[12-14]，HIROAKI等[15]研究发现在ECSS组织中，MTA1与CD34的表达呈正相关，其诱导的HIF⁃1α/VEGF是血管生成的关键因子，而MTA1与MTA2均属于MTAs家族成员，二者在蛋白结构上有65%的同源性，提示MTA2可能具有与MTA1相似的生物学功能。本研究发现MTA2在ESCC组织中高表达，且MTA2在细胞核中表达越高，ESCC细胞分化程度越低，说明MTA2表达上调是促进食管癌发生发展的一个重要因素。伴有淋巴结转移的ESCC组织中MTA2表达显著高于无淋巴结转移组织；在TNM分期中，Ⅲ+Ⅳ期的ESCC组织中MTA2表达高于Ⅰ+Ⅱ期组织，说明MTA2作为癌基因促进ESCC细胞的侵袭与转移。

研究表明，新生血管形成在多种恶性肿瘤的生长、侵袭和转移中发挥着重要的作用，而MVD是评估肿瘤血管生成的金标准[16-18]。在本研究中，CD34在ESCC中呈阳性表达，ESCC组织中MVD与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关，说明MVD与ESCC浸润与转移密切相关。在ESCC组织中，MTA2表达与MVD呈正相关（r=0.777，P＜0.01），MTA2表达越高的ESCC组织中MVD值也越高，提示MTA2与ESCC新生血管生成密切相关。笔者推测，MTA2可能通过诱导血管生成使ESCC细胞获得更具侵袭性表型而增强ESCC侵袭和转移能力，但具体机制尚不明确。下一步研究将采用RNA干扰技术特异性的下调ESCC细胞中MTA2表达，并通过质粒转染过表达MTA2，探讨MTA2对ESCC细胞侵袭和转移的影响及血管生成在以上生物学现象中的作用。

综上所述，MTA2和CD34表达与ESCC侵袭和转移的密切相关，联合检测MTA2和CD34的表达可能为诊断ESCC转移提供重要依据，并可能成为抗ESCC血管生成治疗提供新的靶点。