MAPK信号通路及STAT3、STAT5A/B在银屑病皮损中表达增高

刘凤杰 栗玉珍

哈尔滨医科大学附属第二医院皮肤科（哈尔滨150001）

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，病因复杂，主要由遗传、免疫、环境相互作用引起，病理表现为皮肤淋巴细胞浸润、表皮增生及角化不全[1]。有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）是一种重要的生长信号调节蛋白，在细胞增殖、分化、凋亡、应激、炎症以及免疫反应等多种生理和病理过程发挥重要作用[2]。研究较为广泛的通路为p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和c⁃Jun氨基末端激酶（c⁃Jun N⁃terminal kinase，JNK）。

信号传导及转录激活因子3（signal transduc⁃ers and activators of transcription 3，STAT3）、STAT5A/B、蛋白 S6激酶 1（170 kDa ribosomal proteinS6 ki⁃nase，p70S6k）、核因子⁃кB（nuclear factor⁃кB，NF⁃кB）、钙反应元件结合蛋白（cyclic⁃AMP response⁃binding protein，CREB）均属于MAPK下游的相关因子。ERK1/2影响细胞增殖、分化，作用于NF⁃кB直接调控相关基因表达[3]。CREB是Ras/ERK、P13激酶/AKt、应激状态诱导的p38 MAPK通路等的磷酸化底物，参与细胞形态变化[4]。Akt与Erk1/2均可以作用于p70S6K及真核启动因子调节下游蛋白质的表达，与恶性肿瘤的发生发展相关[5]。在肿瘤炎性微环境中，Src家族激酶（Src family ki⁃nase，SFK）可通过激活 MAPK（包括 JNK、p38、ERK1/2等）通路上调STAT3的磷酸化水平[6]。

目前研究表明部分因子在银屑病发病机制中发挥重要作用，但存在各种不同结果。本文以MAPK信号通路相关的9种因子p38、ERK1/2、Akt、STAT3、STAT5A/B、JNK、p70S6k、NF⁃кB、CREB 为研究对象，检测它们在银屑病皮损中的具体蛋白表达情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料所有寻常型银屑病皮损于2017年3-9月在哈尔滨医科大学附属第二医院皮肤科收集，共27例（银屑病组），其中女13例，男14例，年龄10～74岁，平均（36.3±17.2）岁。平均皮损面积和严重程度指数（PASI）评分为（6.46±3.7）分。局部麻醉（1%利多卡因）后，以手术切取法从每例患者皮损处取出至少4 mm的活检组织，并将其储存在液氮中。受试者在皮肤活检前至少2周未接受局部治疗，至少1个月未接受全身免疫抑制治疗，3个月内未接受系统维A酸类药物治疗。另外，同时收集哈尔滨医科大学附属第二医院进行整形手术的正常皮肤组织（4～10 mm）19例作为对照组。女13例，男6例，年龄13～68岁，平均（34.5±15.0）岁。本研究经哈尔滨医科大学附属第二医院医学伦理委员会及所有患者或监护人（18岁以下患者）签署知情同意书。

1.2 主要试剂Multi⁃Pathway 9⁃plex Magnetic Bead Panel 96⁃well Plate（美国Luminex公司）；磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，RIPA，BSA蛋白标准品等（罗氏和碧云天公司）。

1.3 实验方法从液氮中取出冻存的标本，用组织研磨仪研磨，RIPA细胞裂解液冰上裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度。严格按照Multi⁃Pathway 9⁃plex Magnetic Bead Panel 96⁃well Plate说明书进行操作，制备10 000 pg/mL标准品、高浓度和低浓度质控品及9种细胞因子混合磁珠，并将标准品稀释5倍制定标准曲线，蛋白标本于室温融化混匀，离心（13 000 r/min、4℃、10 min、离心半径6 cm）后取上清。将25 μL标准品、质控品及待测样本分别与25 μL预混磁珠和25 μL缓冲液混合，4℃摇床过夜。将反应体系置于磁板上60 s，清洗，加25 μL MILLIPLEX®MAP检测抗体室温下震荡1 h，加25 μL显色剂室温下震荡反应30 min。将反应体系置于磁板上60 s，清洗，加入150 μL鞘液并使用Luminex公司液相芯片分析系统进行9种因子定量分析。样本均采用复孔，结果取平均值。

1.4 统计学方法采用SAS 9.1.3软件进行统计学分析，蛋白表达量的统计描述采用均数±标准差（满足正态分布）或中位数和四分位数间距（不满足正态分布）表示，银屑病组和对照组蛋白表达量的差异性分析采用两独立样本t检验或Wilcoxon秩和检验，变量间的相关性分析采用Pearson相关（满足双变量正态分布）或Spearman秩相关（不满足双变量正态分布）；采用Origin软件绘制箱式图。

2 结果

2.1 JNK、p38、ERK1/2、STAT3、STAT5的蛋白表达量比较t检验和Wilcoxon秩和检验分析结果显示，银屑病组和对照组JNK、p38、ERK1/2、STAT3、STAT5的蛋白表达量差异有统计学意义，且均表现为银屑病组的表达量高于对照组。见表1和图1、2。

表1 蛋白表达量的差异性分析结果Tab.1 Analysis of protein expression levels

2.2 部分因子间的相关性分析结果Spearman秩相关分析结果显示，STAT5与p38、ERK1/2、JNK、STAT3之间均呈正相关。见表2。

3 讨论

图1 对照组与银屑病组p38、ERK1/2、JNK MAPK的蛋白表达Fig.1 Compare the p38，ERK1/2，JNK MAPK between PV patients and controls

图2 对照组与银屑病组SATA3、STAT5的蛋白表达Fig.2 Compare the SATA3，STAT5 between PV patients and controls

表2 部分因子间的相关性分析结果Tab.2 Correlation analysis between some factors

本实验的研究目的是定量分析9种因子在寻常型银屑病中的蛋白表达情况，为以后更深入的研究提供更准确的参考。已有研究发现9种因子在银屑病中均有一定的相互作用，如ZHENG等[7]发现在银屑病皮损中，p38表达明显增高，并促进炎症反应；银屑病发病的重要炎症因子：肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）和IL⁃1可激活NF⁃кB和MAPK通路，诱导细胞增殖[8]；IL⁃22通过STAT3和ERK1/2途径诱导角蛋白17（银屑病相关性细胞角蛋白）表达，导致银屑病炎症反应和角质细胞异常增生等病理改变[9]；银屑病角质细胞中JNK受CREB调节表达增高[10]，参与炎症反应，诱导TNF⁃α、IL⁃17、IL⁃6表达[11]，这些炎症因子也可被 p38通路调控[12-13]。因此，在银屑病中这些因子共同作用，使角质形成细胞异常增殖和凋亡，出现炎症因子异常表达。

从蛋白定量看到银屑病皮损处JNK、p38、ERK1/2、STAT3、STAT5的蛋白表达均较正常皮肤增高，在银屑病皮损中含量较高且变化最大的是p38，提示p38在银屑病发病进程中发挥较为重要的作用。

很多银屑病一线用药也发现与这些因子相关，尤其是p38 MAPK。研究表明阿达木单抗可以抑制p38 MAPK和ERK1/2，可能是阿达木单抗治疗银屑病作用的机制之一[14]；这与复方甘草酸苷治疗银屑病的机制有相似之处，通过抑制p38 MAPK和ERK1/2及NF⁃кB来治疗银屑病皮损的炎症反应[15]；阿维A可能通过降低STAT1和STAT3依赖机制的表达抑制银屑病角质形成细胞的增殖[16]；芍药甙能明显抑制银屑病JNK和p38 MAPK的表达[17]等等，为治疗银屑病提供一个更好的研究方向。

本研究首次发现STAT5在银屑病皮损中表达增高，STAT3与STAT5同属信号传导及转录激活因子，在细胞内（T淋巴细胞、自然杀伤细胞等[18-19]）作用机制非常广泛，可相互调节，但两者有时介导不同甚至相反的生物效应。例如IL⁃6介导激活STAT3与STAT5，驱动Th9细胞的活化[20]，产生的IL⁃9能增加银屑病患者皮肤损伤[21]。但也有研究表明，STAT5与STAT3有部分共同的基因位点，STAT5可抑制STAT3表达，从而抑制Th17细胞分化[22]（Th17细胞已知在银屑病中发挥重要作用，其主要产生IL⁃17促进银屑病炎症反应[23]）。本实验结果表明STAT3与STAT5的表达呈正相关性（P=0.003 2），表明两者之间具有协同作用，或者协同作用大于拮抗作用，且与p38、ERK1/2、JNK表达正相关，推测在银屑病中MAPK信号通路也可能影响STAT5和STAT3途径而发挥炎性作用。

另外本研究发现p38与JNK、NF⁃кB、ERK1/2，ERK1/2与CREB、STAT3，Akt与p70S6K，STAT5与p38、ERK1/2、JNK、STAT3之间均呈正相关（P＜0.05），也系统地表明了9种因子相互作用，可能共同参与银屑病发病机制，符合银屑病多因子共同参与的发病机制，但其具体机制仍需要进一步研究探索。