SERPINA 3在舌鳞状细胞癌组织中表达及临床意义

王圣娣，熊 莉，郭 艳

(1. 鄂东医疗集团黄石市中心医院 湖北理工学院附属医院 口腔科，湖北 黄石 435000；2. 中国医科大学第四医院 口腔科，辽宁 沈阳 110000)

舌鳞状细胞癌(简称舌癌，tongue squamous cell carcinoma，TSCC)作为口腔科常见的恶性肿瘤，发病率呈不断上升趋势[1]，由于该肿瘤生长快、侵袭力强，多数患者临床确诊时已发生转移，是导致患者预后不佳的主要因素[2]，近年来虽然临床诊疗手段不断进步，但患者5年生存率提高有限[3]。研究发现[4]，TSCC发生进展涉及多个癌基因或抑癌基因。但其具体发生机制尚未完全清楚。因此，深入探讨TSCC发生的分子机制对改善患者预后具有重要意义。丝氨酸蛋白酶抑制因子A类3(serpin peptidase inhibitor clade A member 3，SERPINA 3)作为丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族重要成员，是一种急性炎症反应蛋白，在炎症反应及细胞增殖、凋亡、黏附等过程中发挥重要作用[5]，与多种恶性肿瘤发生及进展关系密切[6]。本研究拟检测TSCC组织中SERPINA 3蛋白表达，探讨其与临床病理特征之间的关系及对预后的影响，以期为TSCC机制研究提供基础资料。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年3月～2012年4月在黄石中心医院口腔科择期行手术治疗的63例TSCC患者，均经术后病理学检查确诊，术前均未行放化疗治疗。其中，男性38例，女性25例，年龄41～76岁，平均年龄(53.7±10.2)岁，分化程度：低分化7例，中分化36例，高分化20例；TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期23例，Ⅲ期17例，Ⅳ期11例；发生颈淋巴结转移39例。同期留取45例因舌外伤或舌部良性病变行手术切除的正常舌黏膜组织作为对照，其中男性25例，女性20例，年龄38～75岁，平均年龄(52.5±9.8)岁，两组患者性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，均衡可比。所有入选对象均由同一医院同一组医师完成手术操作。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者均行知情同意。

1.2 主要试剂和设备 免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司，兔抗人SERPINA 3多克隆抗体购自美国Abcam公司，总RNA提取试剂盒(Trizol法)购自美国Invitrogen公司，反转录和PCR试剂盒购自美国Promega公司，SERPINA 3和内参引物均由上海生工生物公司设计合成，实时荧光定量PCR仪购自德国AJ公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化法检测TSCC和对照组的组织中SERPINA 3蛋白表达 分别将TSCC和对照组的组织用甲醛固定，石蜡包埋，切片，厚度约3 μm，脱蜡，梯度乙醇至水，置于10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中，95℃水浴20 min，加入0.3%过氧化氢15 min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，用1%山羊血清于室温下封闭60 min，将一抗兔抗人SERPINA 3多克隆抗体(1∶1000稀释)加入，4℃过夜孵育，加入二抗，37℃孵育60 min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，以PBS代替一抗作为对照。结果判定：SERPINA 3主要表达于细胞质，以胞质中出现黄色或棕黄色染色为阳性。随机取5个高倍视野，以染色强度和阳性细胞比例综合评价[7]，①染色强度：0分，无染色；1分，淡黄色；2分，黄色；3分，棕黄色；②阳性细胞比例：0分，<5%；1分，5%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，≥75%；③根据染色强度和阳性细胞比例得分之和进行判定：0～分，阴性(-)，2～7分，阳性(+)。所有切片均由2位病理科具有主任医师职称的医师单独双盲完成，并取得一致结果。

1.3.2 实时荧光定量PCR技术检测TSCC和对照组组织中SERPINA 3基因表达 取TSCC或对照组组织，研磨后加入细胞裂解液，提取细胞中总RNA，并用紫外分光光度计检测纯度。用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，用PCR试剂盒对目的基因进行扩增。SERPINA 3基因序列：上游为5′-AAGAGGTAGAGGATAGGG-3′，下游为5′-ATACTATAAACACTCTCCTCT-3′；GAPDH基因：上游为5′-AAGATCATCAGCAATGCCTCC-3′，下游为5′-TGGACTGTGGTCATGAGTCCTT-3′。PCR反应条件：95℃ 5 min，92℃ 30 s，92℃ 30 s，60℃ 30 s，75℃ 30 s，连续进行38次循环，每个样品设3个平行反应复孔。用2-△△Ct法计算TSCC和对照组组织中SERPINA 3 mRNA相对表达量。

1.3.3 病例随访 对所有患者治疗后进行随访，随访形式包括电话、门诊，随访中失访3例，随访截止至2017年4月30日。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，计数资料采用率值表示，组间比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法，利用Cox比例风险回归模型分析TSCC患者生存的影响因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组SERPINA 3的蛋白表达 TSCC组织中SERPINA 3蛋白阳性表达率为71.43%(45/63)，对照组则为33.33%(15/45)，差异有统计学意义(χ2=15.429，P=0.000)，见图1。

A.SERPINA 3蛋白在TSCC组织中呈高表达；B.SERPINA 3蛋白在对照组组织中呈低表达，SP×200。

图1 两组SERPINA 3蛋白表达

2.2 两组SERPINA 3的基因表达 TSCC组织中SERPINA 3 mRNA相对表达量为2.08±0.12，对照组则为1.16±0.08，差异有统计学意义(t=44.711，P=0.000)。

2.3 TSCC组织中SERPINA 3蛋白和基因表达与临床病理特征之间的关系 TSCC组织中SERPINA 3蛋白和基因表达均与性别和年龄无关(P>0.05)，而与分化程度、TNM分期和颈淋巴结转移有关(P<0.05)，见表1。

表1 TSCC组织中SERPINA 3蛋白和基因表达与临床病理特征之间的关系

2.4 TSCC组织中SERPINA 3蛋白表达对预后的影响 Kaplan-Meier生存分析结果显示，SERPINA 3蛋白阳性表达组患者5年总体生存率为34.88%，中位生存时间36.30个月，阴性表达组则分别为64.71%和51.24个月，Log-Rank检验差异有统计学意义(χ2=4.830，P=0.028)，见图2。

2.5 TSCC患者预后影响因素分析 Cox比例风险回归模型分析结果显示，SERPINA 3蛋白阳性表达、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、发生颈淋巴结转移是TSCC患者预后的独立影响因素，见表2。

图2 TSCC组织中SERPINA 3蛋白表达对预后的影响

表2 TSCC患者预后影响因素的Cox比例风险回归模型

3 讨论

TSCC作为一种侵袭力强、生长迅速、恶性程度高的恶性肿瘤，可导致舌肌运动受限，对患者言语、吞咽、进食等功能造成影响[8]，而且该肿瘤早期转移率较高[9]，多数患者预后不良。目前，TSCC发病机制尚未完全清楚，因此，深入探讨影响该肿瘤侵袭、转移的机制对改善患者预后具有重要意义。SERPINA 3基因位于人染色体14q32.1，是一种炎症反应相蛋白，在机体发生炎症反应时表达增加具有抗炎功能[10]，但一旦出现SERPINA 3基因大量异常表达时，可抑制细胞凋亡、减少细胞间黏附，而参与了恶性肿瘤发生及进展过程[11]。已有研究表明，其在子宫内膜癌[12]、结直肠癌[13]、肝癌[14]等多种恶性肿瘤组织中表达上调。本研究结果显示，TSCC组织中SERPINA 3蛋白阳性表达率和基因表达量均高于对照组，说明SERPINA 3在TSCC组织中呈高表达，可能参与了TSCC发病过程。

本研究结果显示，TSCC组织中SERPINA 3蛋白和基因表达均与分化程度、TNM分期和颈淋巴结转移有关，中低分化、Ⅲ～Ⅳ期和发生颈淋巴结转移患者组织中表达量增加，表明SERPINA 3可能参与了TSCC进展过程，与肿瘤恶性进展及转移过程有关。有研究指出[15]，SERPINA 3高表达与黑色素瘤患者高病死率有关。本研究结果显示，SERPINA 3蛋白阳性表达组患者5年总体生存率和平均生存时间均低于阴性表达组，说明SERPINA 3蛋白高表达影响患者预后，Cox比例风险回归模型分析结果进一步显示，SERPINA 3蛋白阳性表达是TSCC患者预后的独立影响因素，因此，SERPINA 3蛋白阳性表达可能是患者预后不良的标志。

综上所述，TSCC组织中SERPINA 3蛋白和基因呈高表达，且与分化程度、TNM分期和颈淋巴结转移有关，是影响患者预后的因素之一，有望成为预测患者预后的生物学标志物。