番泻叶中番泻苷A、B的稳定性探究

胡 军，毕海林，杨 敬，苏 玲，肖裕章，潘 瑶，唐建华

(1.西南大学荣昌校区，重庆荣昌402460 ； 2.重庆方通动物药业有限公司，重庆荣昌402460)

番泻叶具有通便导滞，泄热利水之功效，主治热结积滞与便秘腹痛。现代药理学研究表明，番泻叶泻下的主要成分为番泻苷类，而其中又以番泻苷A、B为主。哈飞和陈丹丹等[1-2]研究发现番泻苷对热不稳定，不能长时间加热。故番泻苷随着温度的改变可能会对番泻叶颗粒剂等相关制剂的质量产生较大影响。为探究番泻苷A、B在制备过程中的稳定性，本试验以番泻苷A、B的含量变化作为指标，考察不同条件下番泻苷A、B的降解情况，为番泻叶颗粒剂的研制与生产提供实验依据。

1 仪器和药品

1.1 仪器 PE2000型高效液相色谱仪(依力特公司)；HH系列数显恒温水浴锅(上海江星仪器有限公司)；AB135-S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 药品 番泻叶药材，购自安徽省亳州市德昌药业有限公司，经新疆药物研究所鉴定为豆科灌木植物狭叶番泻叶Cassia angustifolia vahl的干燥小叶；对照品番泻苷A(中国食品药品检定研究院，批号110824—201301)、番泻苷B(中国食品药品检定研究院，批号110825—201502)；甲醇和乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 番泻苷A和番泻苷B分析方法的建立

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取番泻苷A﹑番泻苷B对照品适量，置于50 mL的棕色量瓶中，加50%甲醇至溶解完全，定容至刻度，制成含番泻苷A 53.9 μg/mL、番泻苷B 91.9 μg/mL的混合溶液，摇匀，即得对照品储备液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取番泻叶粉0.5 g，置50 mL量瓶中，用50%甲醇溶解，超声处理30 min，放冷，定容，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 色谱条件 Ultimate XB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈:5 mmol/L四庚基溴化铵的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值=5)(35∶65)；柱温40 ℃；流速1 mL/min；进样体积20 μL；检测波长340 nm。该色谱条件下番泻苷A、B分离度良好，对照品及供试品的色谱图见图1。

图1 番泻苷A、B混合对照品(a)，供试品(b)的色谱图

2.1.4 线性关系考察 用50%甲醇配制质量浓度为2.42、4.85、9.69、19.38、38.76、77.52 μg/mL和155.04 μg/mL番泻苷A及2.95、5.91、11.83、23.65、47.30、96.40 μg/mL和189.20 μg/mL番泻苷B系列对照品溶液，按照“2.1.3”项下色谱条件进行分析。以对照品峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，回归方程为：番泻苷AY=10 964X+40 111(R=0.999 9)；番泻苷BY=11 227X+15 105(R=0.999 9)，表明番泻苷A、B分别在2.42～155.04 μg/mL及2.95～189.20 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.5精密度试验 精密吸取番泻苷A、B对照品溶液各6份，按“2.1.3”项下色谱方法进行测定，得番泻苷A峰面积RSD值为1.06%，番泻苷B峰面积RSD值为0.87%，均小于2%(n=6)，表明所选用的仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 按“2.1.1”项下制备对照品溶液，分别于0、2、4、6、8 h进样，按“2.1.3”项下方法测定，结果显示,番泻苷A峰面积RSD值为1.71%，番泻苷B峰面积RSD值为1.22%，表明对照品溶液在该检测系统和方法下，8 h内能够保持稳定。

2.1.7 加样回收率试验 按“2.1.2”项下制备供试品溶液，得番泻苷A供试品溶液浓度为19.38 μg/mL，番泻苷B供试品溶液浓度为47.30 μg/mL，以供试品溶液的浓度为初始浓度。取适量番泻苷A、B对照品于10 mL量瓶中，用供试品溶液溶解并定容，使加入的浓度约为初始浓度的80%、100%和120%，每一浓度进行3次平行试验，按“2.1.3”项下方法进行测定，计算平均回收率。所得平均回收率番泻苷A为98.92%，RSD值为1.03%；番泻苷B为98.90%，RSD值为0.73%，结果见表1。

初始浓度/μg/mL加入量/μg加入浓度/μg/mL测得浓度/μg/mL回收率/%RSD/%番泻苷A19.38148.20±1.3714.82±0.1434.01±0.3398.73±1.39214.86±3.0521.49±0.3140.71±0.5999.26±1.34240.72±1.2824.07±0.1343.15±0.2098.77±0.431.03番泻苷B47.30391.74±2.1139.18±0.2186.26±0.2599.45±0.95494.32±3.4049.43±0.3496.03±0.3298.57±0.21553.30±5.0655.33±0.51101.89±0.2298.68±0.690.73

2.2 经典恒温加速试验 精密称取1 mg番泻苷A和B，分别用50%乙醇、50%甲醇、0.1%碳酸氢钠和水充分溶解再密封于安瓿瓶中，将每个溶剂的安瓿瓶分为4组，分别放入50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃的恒温水浴锅中，即刻起记为0 h，恒温加热，于不同时间点取样，溶液过0.45 μm滤膜，进样20 μL，记录峰面积。以0 h为100%，其他时间与0 h相比，计算药物残留百分率，以残留率的自然对数对时间作图，按lnCi=-kt/2.303+lnC0方程求得同一温度、同一溶剂中的反应常数k，结果见表2。

由表2可知，温度是影响番泻苷A、B的主要因素，随着温度的升高，番泻苷A、B的降解速率均增大，且番泻苷B的降解速率大于番泻苷A。根据Arrhenius公式求得同一溶剂的线性回归方程及t0.9，并以溶剂为横坐标，lnk为纵坐标对不同溶剂、不同温度反应常数的自然对数作图，结果见表3、图2。

表2 番泻苷A、B的一级动力学方程反应常数

表3 番泻苷A、B的Arrhenius方程

图2 番泻苷A(A)和番泻苷B(B)降解的溶剂速率图

Ink:反应常数的自然对数(Ink值越大，则番泻苷的降解速率就越快)

由图2可以看出，随着温度的升高，番泻苷A、B的k值逐渐上升，即温度越高，番泻苷A、B的稳定性越差；不同溶媒之间进行横向比较，发现溶媒为50%乙醇和50%甲醇时，其k值低于溶媒为0.1%碳酸氢钠和水的k值，故溶媒为50%乙醇和50%甲醇时，番泻苷A、B的稳定性较好。

2.3 番泻苷A、B在不同体积分数乙醇中的稳定性[3]选用30%、50%、70%和90%体积分数的乙醇作为考察因素。称取适量番泻苷A和B加入上述溶剂中溶解，分装于不同安瓿瓶中，熔封，置70 ℃±2 ℃恒温水浴锅中进行加速试验，于0、2、4、6、8 h时分别取样20 μL，进样，按“2.1.3”项下色谱条件进行分析，计算番泻苷A、B的百分残留率，结果见图3。

从图3可以看出，在70 ℃水浴条件下，番泻苷A、B在30%和50%乙醇中稳定，而在70%和90%乙醇中均不稳定，尤其在90%乙醇中最容易降解；番泻苷B比番泻苷A在高醇中更不稳定，在70 ℃高温条件下，加热8 h，番泻苷A在90%乙醇溶液中降解49.18%，而番泻苷B则降解了88.13%。

3 讨论

番泻苷类化合物具有酚羟基和羧基，具有一定酸性，在碱水中成盐而溶解，故可用碳酸氢钠溶液溶解。此外，番泻苷类化合物除了以游离酸的形式存在外，还以钙盐的形式大量存在于植物中，所以传统方法中一般用水来提取番泻苷。但也有文献报道，加醇有利于番泻苷类化合物的溶出[5]。

图3 在70 ℃下番泻苷A(A)、番泻苷B(B)在不同体积分数乙醇中降解的残留百分率

本试验通过经典恒温法考察番泻苷A和番泻苷B在不同溶剂、不同温度和时间的稳定性时，发现温度是影响番泻苷A、B稳定性的主要因素，在高温条件下，番泻苷A和番泻苷B易发生降解，且番泻苷B的降解速率更快，这与于波涛等[5]的研究结果是一致的；此外，溶剂也会对番泻苷A、B的稳定性产生影响，试验发现，当溶媒为乙醇时，番泻苷A、B的降解速率低于其他溶媒，通过番泻苷A、B在不同浓度乙醇的稳定性的研究发现番泻苷A、B在30%、50%等较低浓度乙醇(极性较大)中稳定，在70%、90%等高醇(极性较小)中容易降解，且在90%乙醇中降解速率最快，由于高醇的极性低于低醇，故番泻苷的稳定性可能与溶媒的极性有关。此外，番泻苷B降解速率比番泻苷A更快，70 ℃水浴加热8 h，番泻苷B的降解速率是番泻苷A的1.8倍。因此，在涉及番泻叶相关制剂的制备工艺时，应充分考虑其稳定性。

除此之外，由Arrhenius方程可知：在温度为70 ℃、溶媒为50%乙醇的条件下，番泻苷A、B的半衰期分别为12.9 h和8.5 h，所以，提取、浓缩时选择65 ℃±5 ℃较为适宜。