ADIPOQ基因多态性与前列腺癌易感性的相关性研究

顾成元，吴俊龙，朱 煜，许 华，秦晓健，朱 耀，戴 波，叶定伟

复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

肥胖往往伴随着胰岛素抵抗、高血糖症、高胰岛素血症、脂代谢紊乱、高血压、高凝和促炎状态等一系列代谢异常和内分泌紊乱［1］，进而影响前列腺癌等激素依赖性肿瘤的发生。脂肪组织可以被认为是一种新陈代谢旺盛的内分泌器官，其分泌的一系列激素、生物活性多肽和细胞因子统称为脂肪因子。与大多数脂肪因子不同，脂联素是唯一的负性调节因子，低脂联素血症与肥胖、代谢综合征及血脂代谢紊乱等密切相关［1］。同时前列腺癌患者的脂联素水平明显降低，且与Gleason评分以及肿瘤分期等均呈负相关［2］，因此脂联素可能是一种“抗癌因子”，能预防前列腺癌的发生［2］。脂联素由ADIPOQ基因编码，据文献报道其多个位点的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与肿瘤的易感性及预后有关，但在不同种族中的研究结果存在差异［3］。本研究旨在探讨ADIPOQ基因标签SNP rs266729和rs182052的多态性与汉族男性前列腺癌易感性之间的关系，并分析其与临床特征的相关性。

1 资料和方法

1.1 研究对象

采用患者对照研究，纳入2007年1月—2012年1月在复旦大学附属肿瘤医院就诊的917例前列腺癌患者，所有患者均经病理组织学确诊。排除标准为病理类型非前列腺腺癌、既往有肿瘤病史以及由其他部位转移而来的前列腺癌。按照年龄匹配（±5岁），从同期前列腺特异抗原（prostate-specific antigen，PSA）＜4 ng/mL、肛指检查正常及无前列腺癌家族史的同一地区健康男性中随机抽取1 036例作为正常对照组。以问卷调查和收集临床患者资料的方法采集全部研究对象的有关资料，包括人口统计学特征、环境暴露因素及肿瘤家族史等。测量身高和体质量，计算体质量指数（body mass index，BMI）。根据世界卫生组织的标准，将BMI≥25 kg/m2作为亚洲人群中肥胖的界定值［4］。

1.2 基因分型检测

每个研究对象均捐献5 mL外周静脉血以获取基因组DNA用于基因分析。采用德国Qiagen公司试剂盒，按照操作步骤提取全基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，采用美国Biotek公司的Hybrid Synergy H4酶标仪检测DNA的浓度和纯度，定量标化至5 ng/μL，于4 ℃下分装备用。采用TaqMan探针法进行基因分型,设计引物和探针购自美国ABI公司。反应体系5 μL，包括1 µL DNA模板、0.125 μL引物探针、2.5 μL TaqMan Universal Master Mix及1.375 µL去离子水。在每个384孔反应板中设置阴性空白对照。扩增条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。扩增之后用ABI PRISM 7900HT荧光定量PCR仪检测荧光分布情况，并应用SDS 2.4软件进行基因分型。随机抽取10%的样本重复实验进行验证，基因型符合率为100%。

1.3 统计学处理

应用Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性。数值变量用非配对的t检验，分类变量采用χ2检验。组间基因型频率及等位基因频率比较采用χ2检验。以非条件Logistic回归模型，对可能的混杂因素（年龄、吸烟状况及BMI）进行校正，计算比值比（odds ratio，OR）和95%CI来评估各种基因型与前列腺发病风险的相关性以及与各有关环境因素之间交互作用的大小。所有统计分析使用SAS 9.1软件完成。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况及临床特征

患者组平均年龄（69.1±7.9）岁，其中≤69岁者占51.0%。对照组平均年龄（68.7±9.0）岁，其中≤69岁者占52.6%。患者组中有吸烟史者559例（61.0%），无吸烟史者358例（39%）。患者组平均BMI为（24.9±2.8）kg/m2，其中超重者388例（42.3%）。对照组平均BMI为（24.2±3.1） kg/m2，其中超重者405例（39.1%）。两组间平均年龄、年龄分布及吸烟情况等差异无统计学意义（P=0.32、0.23和0.74）。但患者组BMI显著高于对照组（P＜0.001），将在进一步的多元Logistic分析进行调整。患者组中Ⅰ/Ⅱ期占46.7%，Ⅲ/Ⅳ期占53.3%。Gleason评分≤7（3+4）者占34.0%，≥7（4+3）者占64.6%，评分不详者占1.4%。

2.2 ADIPOQ rs266729和rs182052多态性与前列腺癌发病风险的关系

经检验对照组中ADIPOQ rs266729和rs182052两位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.29和0.83），表明本研究人群具有良好的群体代表性。

ADIPOQ rs266729和rs182052两位点的基因型和等位基因频率在患者组和正常对照组中的分布差异均无统计学意义（P＞0.05，表1）。对年龄、吸烟状况及BMI校正后的非条件Logistic分析显示，与野生型CC及GG基因型相比，两位点的杂合型及突变型携带者患病风险差异无统计学意义（P＞0.05）。在显性遗传效应模型及隐形遗传效应模型下，差异亦无统计学意义（P＞0.05）。

表 1 ADIPOQ rs266729和rs182052基因型分布及其与前列腺癌发病风险的关系Tab. 1 Logistic regression analysis of associations between the ADIPOQ polymorphisms and prostate cancer risk［n (%)］

2.3 ADIPOQ rs266729和rs182052多态性与前列腺癌患者临床特征的相关性分析

进一步按照患者的年龄、BMI、吸烟状况、Gleason评分及临床分期进行分层分析（表2）。结果显示，在年龄≤69岁的人群中，ADIPOQ rs182052 AA基因型携带者的前列腺癌发病风险仅为AG或GG基因型携带者的73%（95%CI：0.54～0.99），差异有统计学意义（P=0.04）。两位点基因型分布差异与其他临床特征之间无显著相关性。

2.4 ADIPOQ rs266729和rs182052多态性与BMI的相关性分析

为了解前列腺癌患者肥胖程度与ADIPOQ基因多态性是否有关，我们比较了患者组中不同基因型携带者的BMI。结果显示，rs182052各基因型携带者的BMI差异有统计学意义（P=0.03），GG型携带者的BMI显著高于AA型或GG型携带者（表3）。

表 2 ADIPOQ rs266729和rs182052基因型与前列腺癌发病风险的分层分析Tab. 2 Stratification analysis for associations between the ADIPOQ polymorphisms and prostate cancer risk(n)

表 3 ADIPOQ rs266729和rs182052多态性与BMI的相关性Tab. 3 ADIPOQ polymorphisms and BMI among cases

3 讨论

在全球范围内，亚洲男性前列腺癌的发病率和死亡率最低，但研究显示，在过去的20年中绝大部分亚洲国家的发病率快速上升［5］。此外，前列腺癌发病率在美国本土居民和亚洲移民之间差异的缩小，反映了环境危险因素对亚洲移民的潜在影响［6］。环境因素在前列腺癌发病机制中的作用，尤其是高脂肪摄入饮食、缺乏体力活动等引起的肥胖逐渐受到重视。前列腺癌与肥胖之间关系的潜在分子机制多种多样且涉及多个层面。其中脂联素等脂肪因子不同程度地参与调节细胞的分化、凋亡、增殖和血管生成，既可通过自分泌和（或）旁分泌方式在局部发挥作用，也可通过进入外周循环来激活靶细胞受体的内分泌方式作用于全身发挥生物学效应，尤其是前列腺癌突破包膜和发生淋巴结浸润后，肿瘤细胞暴露于高浓度的增殖因子中，增强其进一步生长和转移的能力［7］。作为外周血中含量最丰富的脂肪因子，脂联素水平的降低不仅意味着总体脂肪含量增加，而且与脂肪分布相关，内脏型肥胖者血浆脂联素水平降低更为显著［8］。我们前期的研究已经证实内脏型肥胖是高危前列腺癌发生的危险因素［9］。其潜在的生物学机制可能与脂联素水平下降导致氧自由基的清除机制受到抑制有关，在肥胖者的前列腺组织中可以观察到明显的脂质过氧化状态、失控的氧化应激和氧化DNA损伤［1］。

由此我们推测ADIPOQ基因多态性可能通过影响脂联素的表达水平，从而影响一般人群散发性前列腺癌的发病风险。事实上Kaklamani等［10］在高加索人群中评估了5个ADIPOQ潜在功能SNP与前列腺癌的相关性，发现了包括rs266729在内的4个SNP与发病风险相关。Dhillon等［11］研究发现，ADIPOQ基因SNP rs266729和rs182052不仅影响高加索人群的血浆脂联素水平，同时与前列腺癌发病风险显著相关。本研究在分层分析中发现rs182052 AA基因型在较低龄人群中会降低前列腺癌的发病风险，而在＞69岁的人群中则没有这种保护作用。这可能是由于随着年龄的增长，血浆脂联素水平逐渐下降而造成的。

本研究未观察到rs266729和rs182052的遗传变异与中国汉族人群总体前列腺癌发病风险的相关性。与我们的结果相似，在一项非洲裔美国男性［12］和另一项芬兰男性［13］的研究中，均未发现rs266729和rs182052与前列腺癌发病风险有关。这表明研究结果之间的差异可能由遗传背景及地区不同造成。例如在Dhillon等［11］的高加索研究人群中，ADIPOQ基因rs182052的A等位基因频率为0.32，而在我们的汉族研究人群中观察到的频率为0.47，两者存在较大差异。并且Dhillon等［11］的患者组多数为局限性前列腺癌患者（83.9%），而我们的研究对象中进展期前列腺癌占多数（53.3%），这可能也是造成研究结果不同的原因之一。此外与我们的研究相比，Kaklamani等［10］的研究样本量偏小、平均年龄更年轻可能也是造成结果不同的原因。

我们的研究也存在一定的局限性，文献报道rs266729和rs182052位于ADIPOQ基因转录起始点上游，其多态性显著降低启动子活性进而影响脂联素水平的表达［14］。但由于未能对研究对象的脂联素水平及其基因表达水平进行检测，因此在后续的功能研究中需要明确脂联素基因多态性、脂联素水平及前列腺癌发病风险之间的关联。另外还需要对该基因上其他的标签SNP进行检测，以全面探讨ADIPOQ基因多态性在前列腺癌发病机制中的作用。