藏药“扎颉俄色”总黄酮醇质体制备工艺的优化

西南民族大学药学院，四川 成都 610041

西南民族大学少数民族药物研究所民族药物新药研发课题组在高原民族药(藏药)生发复方“扎颉俄色”的前期研究中发现，“扎颉俄色”有效部位总黄酮提取物(ZJESF)较原复方具有更好的局部活化毛囊促进毛发生长的作用[1-3]。但是，ZJESF溶解性较差，皮肤透过性差，药物直接应用于皮肤的疗效不明显。醇质体(Ethosomes)是由磷脂、高浓度(20%～45%)乙醇和水组成，具有脂质双分子层囊泡结构的一种新型柔性脂质体[4]。易于透过皮肤屏障，有效地携带药物到达皮肤深层细胞，促进药物透皮吸收，因而可显著提高药物的经皮渗透速率以及药物在皮肤内的滞留量，是一种较为理想的透皮载体。因此，本研究计划将ZJESF制备成一种新型局部外用醇质体[5]，为进一步开发出一种安全、有效、生物利用度高、具有毛囊皮脂腺靶向作用的治疗脱发疾病的新型外用制剂提供质量可靠的醇质体中间体。本文进行ZJESF醇质体的处方、制备工艺优化和质量评价研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters2695高效液相色谱仪(DAD检测器、Waters 2996 Empower色谱工作站，美国Waters公司)；MS-2000激光粒度分析仪(英国malvern公司)；KQ-250B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；JSM-7500F扫描电镜(日本电子株式会社)；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器(上海广英仪器有限公司)；ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)；TGL-16B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；SENCO-R型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)。

1.2 材料 甲醇(AR)、胆固醇(AR)、蛋黄卵磷脂(AR)、三氯甲烷(AR)、无水乙醇(AR)、二氯甲烷(AR)，甲基纤维素(AR)、羧甲基纤维素钠(AR)、磷酸二氢钾(AR)、磷酸氢二钾等均为成都市科龙化工试剂厂生产；ZJESF(总黄酮)(批号：20160508，总黄酮含量为60%，西南民族大学少数民族药物研究所提供)；俄色黄酮(SFH)对照品(批号：20160106，纯度>98%，西南民族大学少数民族药物研究所提供)。甲醇为色谱纯(迪马公司)。

2 方法与结果

2.1 SFH含量测定方法的建立及验证

2.1.1 供试溶液的制备

2.1.1.1 对照品溶液的制备 精密称取SFH对照品100 mg，置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得到浓度为 1 mg/mL 的储备液。

2.1.1.2 供试品溶液的制备 精密量取ZJESF醇质体溶液2.0 mL，加45%乙醇溶液稀释定容至25 mL，摇匀，精密吸取1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，超声破膜，摇匀， 即得供试品储备液。

2.1.1.3 空白溶液的制备 采用注入法制备不含ZJESF的空白醇质体，精密量取ZJESF醇质体溶液2.0 mL，加45%乙醇溶液稀释定容至25 mL，摇匀，精密吸取1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，超声破膜，摇匀， 即得空白液溶。

2.1.2 检测波长的确定 取对照品储备液，以甲醇做作为空白，用紫外-可见分光光度计在波长200～800 nm范围内进行扫描，根据扫描结果选择 285 nm 作为检测波长。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：Phenomenor Luna C18柱(250 mm×4.6 mm 5 μm)；柱温：25℃；检测波长：285 nm；流动相：甲醇-水(2∶3)。体积流量为1.0 mL/min，进样量：10 μL。

2.1.4 专属性考察 取“2.1.1”项下标准品溶液、空白溶液及供试品溶液，0.45微孔滤膜过滤，HPLC法测定其吸收峰。结果，在“2.2.3”项色谱条件下，空白脂质体无吸收，说明辅料对主药的测定无干扰。结果 SFH的分离度大于1.5，理论塔板数大于 10 000。

2.1.5 精密度实验 取“2.1.1 .1”项下SFH对照品储备液1 mL，置于 20 mL 量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，0.45 μm微孔滤膜过滤，按色谱条件进样，于 1 d 内连续进样6次，测定测定其峰面积，结果显示RSD%值为0.24(n=6)，表明方法精密度良好。

2.1.6 线性关系考察 精密量取“2.1.1.1”项下SFH对照品储备液，并将储备液稀释成质量浓度为10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL 的一系列标准溶液，0.45 μm的微孔滤膜过滤，按色谱条件进样， HPLC法测定其峰面积，浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线，考察其线性关系。得线性方程为Y=3×107X+865115(R2=0.9995)，结果表明：SFH在0.010～0.100 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.7 稳定性考察 精密量取“2.1.1.1”项下标准品和SFH对照品储备液，室温放置1、2、4、6、8、12、24、48、72 h 后，0.45 μm微孔滤膜过滤，分别进样10 μL进行测定，记录峰面积，结果，两者RSD%分别为1.3%和2.4%，表明标准溶液在 72 h 内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取6份已知含量的醇质体溶液，分别精密加入SFH对照品20.0 mg，制备加样回收供试品溶液，照“2.1.3”项下色谱条件进样测定含量，计算回收率。平均回收率98.0%，RSD%为1.6。

2.1.9 重复性实验 取同一份 ZJESF醇质体，按照供试品溶液的制备方法平行制备 6 份，分别注入液相色谱仪，验证方法的精密度，测定得其RSD为0.94%。

2.2 ZJESF醇质体的制备工艺和处方研究及结果

2.2.1 ZJESF醇质体的制备 根据参考文献[6-7]和预试结果采用注入法制备醇质体。通过单因素筛选工艺条件，得醇质体制备工艺如下：精密称取处方量的ZJESF、蛋黄卵磷脂、胆固醇，加入处方量无水乙醇溶解并定容，构成有机相；另取一定量纯化水加入混合容器中，置于磁力搅拌器(700 r/min)上，构成水相。将有机相用注射器针头缓慢加入至水相中，注完后继续搅拌2 h，搅拌温度保持在50℃，自然冷却后超声20 min， 即得[8]。

2.2.2 ZJESF醇质体的处方及工艺优选 依据预实验考察结果，选择对ZJESF醇质体制剂包封率影响较大且规律不明显的3个因素，即卵磷脂与药物比(A)、卵磷脂与胆固醇比(B)，醇浓度(C)、3个因素都取3个水平，并以包封率为主要优化指标，在“2.2.1”的基础上采用L9(34) 正交实验进行制备工艺及处方的筛选[9]。

取蛋黄卵磷脂与ZJESF比例(w/w)、蛋黄卵磷脂与胆固醇比例(w/w)、含醇量3个因素水平进行处方及工艺优选，因素水平见表1，正交实验结果见表2。

表1 因素水平表

根据正交实验设计结果分析表明，按积差R的大小排列，各因素对ZJESF醇质体包封率的影响程度依次为： A = C>B。蛋黄卵磷脂与药物比(A)和醇浓度(C)，两者影响程度相当，而蛋黄卵磷脂与胆固醇比(B)影响程度最小。所以，结合单因素考察结果，A2B2C1为最优条件，得到最佳处方及工艺为：ZJESF为5%、蛋黄卵磷脂与药(ZJESF)比为8∶1(w/w)、含醇量为45%(v/v)、蛋黄卵磷脂与胆固醇比为3∶1(w/w)PBS溶液。精密称取处方量的ZJESF、蛋黄卵磷脂、胆固醇，加入处方量无水乙醇溶解并定容，构成有机相；另取一定量纯化水加入混合容器中，置于磁力搅拌器(700 r/min)上，构成水相。将有机相缓慢加入至水相中，加完后继续搅拌2 h，搅拌温度保持在50℃，自然冷却后超声20 min，即得。

表2 试验设计和结果

2.2.3 粒径和Zeta电位的测定和形态观察 取优化方案制备的ZJESF醇质体适量，适当稀释后，采用激光粒径分析仪分别测定ZJESF醇质体的以粒子体积为权重的重量平均粒径分布和Zeta电位。由粒径分布和Zeta电位可以得出，ZJESF醇质体的平均粒径为(296.6±5.8) nm，(PDI值0.26)，Zeta电位为(-14.4±2.3) mV。

取优化方案制备的ZJESF醇质体少量，用PBS溶液稀释200倍，将稀释样品超声5 min，使其均匀分散；用毛细管将样品滴于导电胶上，置于烤灯下烘干(温度低于50℃)；将导电胶粘到载物台上，固定好并喷金；置于JSM-7500F型扫描电镜下观察其外观形态。制备的ZJESF醇质体为均一乳白色混悬液，无沉淀，无分层。如图1所示，该ZJESF醇质体外观呈球状或类球型，粒径大小适中。

2.2.4 醇质体包封率的测定 采用超离心法测定醇质体的包封率：精密移取ZJESF醇质体 2 mL于离心管中，于4℃下离心， 10 000 r/min 离心 30 min，取上清液，补足溶剂(与处方量相同浓度的乙醇水溶液)，同条件下再次离心，合并上清液测定上清液ZJESF量(mL)；另取醇质体混悬液0.1 mL 于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容，超声15 min 破膜，测得总药量(m)，包封率按下式计算： p 包封率 (%) = (1- mL/m)×100%。采用高速离心法测定最佳处方最佳制备工艺制备的醇质体三批，得到其包封率分别为72.4%、72.6%、71.6%，因此得到SFZH醇质体平均包封率为72.2%。

2.2.5 工艺验证试验 三批ZJESF醇质体(工艺验证规格为：50 mL)样品工艺验证试验结果见表3。试验结果表明，三批ZJESF醇质体样品的平均包封率为71.3%，RSD为1.5%(n=3)，与正交实验值相当，表明工艺合理、可行。

表3 工艺验证试验结果 (n=3)

3 讨论

影响醇质体包封率的因素有很多，如药物的性质、药物与脂质的比例、醇和脂质的种类和用量、制备方法等。其中，醇质的制备方法最常用的为注入法和薄膜分散法。考虑到薄膜分散法会存在有机溶剂残留、制膜薄厚不均匀及不宜工业化生产的问题，本实验选用注入法。以ZJESF醇质体的包封率为指标，通过单因素考察和正交优化法进行实验设计，确定ZJESF醇质体制备的最佳处方及最佳工艺参数[6]。由单因素考察可知：药物量、超声时间、搅拌速度及制备温度对包封率、粒径、电位的影响不是很大，综合考虑各方面的因素，药物量定为5%，超声时间定为20 min，搅拌速度定为700 r/min。卵磷脂与主药比例、卵磷脂与胆固醇比例、含醇量对包封率影响较大且规律不明显，将3个因素作为正交实验设计优化法考察的因素，继续对其进行考察。