HPLC法测定二十五味绿绒蒿丸中羟基红花黄色素A的含量

西藏自治区食品药品检验研究院，西藏 拉萨 850000

二十五味绿绒蒿丸系藏族验方，收载于1995年《中华人民共和国卫生部药品标准》藏药第一册，由绿绒蒿、红花、肉桂、沉香、牛黄、甘草、木香、葡萄、诃子、丁香等25味药材组成，具有解毒、清肝热的功效，临床用于中毒及“木布”降于肝腑、肝热、肝肿大、肝硬化、肝胃瘀血疼痛等新旧肝病。藏药二十五味绿绒蒿丸以前都是以研究显微鉴别为主，现行标准没有含量测定方法，为保证二十五味绿绒蒿丸质量可靠性，经查阅资料，研究以含量测定作为方向，对于保证其质量和临床疗效具有重要意义[1]。

1 仪器与材料

1.1 仪器 液相色谱仪(Waters公司)；Mettler XP205型电子天平(精密度为十万分之一)、Mettler XP504电子天平(精密度为万分之一)。色谱柱：安捷伦(5 μm, 250 mm × 4.6 mm) C18柱。

1.2 材料 乙腈(批号：2016.215)、甲醇(批号：20160824)为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其它试剂为分析纯。羟基红花黄色素A对照品(批号：111631-201108，中国药品生物制品检定所)。二十五味绿绒蒿丸(样品1批号20100407，青海柴达木高科技药业有限公司；样品2批号07358A，西藏自治区藏药厂；样品3批号08038A西藏自治区藏药；样品4批号08038A，西藏自治区藏药厂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)；检测波长：402 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；用紫外检测器检测。

2.2 供试品溶液制备 取样品粉末(过四号筛)，各约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入25%甲醇溶液25 mL，精密称定重量，超声处理30 min，冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液为供试品溶液。

2.3 对照品溶液制备 取羟基红花黄色素A对照品18.10 mg，对照品纯度91.8%，用25%甲醇溶解，定容于25 mL的容量瓶中，得对照溶液0.6646 mg /mL，进样量10 μL。

2.4 色谱条件与系统适用性试验[2-3]

2.4.1 检测波长的选择取羟基红花黄色素A适量用流动相稀释成一定的浓度，流动相为空白。在190～450 nm波长范围进行紫外扫描，结果显示在402 nm处有最大吸收，其与文献相符[2]，故选择402 nm作为本品的检测波长。

2.4.2 系统适用性试验 色谱柱的理论板数(n)、分离度(R)测定：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)；检测波长402 nm；柱温30℃；流速为1.0 mL/min；用紫外检测器检测。在此条件下，羟基红花黄色素A和其它组分均能达到基线分离(如图1所示)。供试品中羟基红花黄色素A保留时间与对照品一致。理论板数n≥4500；分离度R≥3.0，系统适用性良好。阴性样品无干扰。

2.4 线性关系的考察 精密称取羟基红花黄色素A，定容成相应浓度的对照品溶液，按上述色谱条件进样，进样量为10 μL，得到相应的峰面积。以羟基红花黄色素A对照品浓度为X坐标，以相应峰面积为Y坐标进行回归处理，得到回归方程y=3E+06x-124011,R2=1。表明样品在0～2 mg/mL范围内线性关系良好。结果如图2所示。

2.5 精密度实验 将同一浓度的羟基红花黄色素A对照品溶液(2.2项下对照品液2)在上述色谱条件下，连续测定5次。根据所得峰面积，RSD=0.3%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 精密称定样品(西藏自治区藏药厂，批号08038A)2.0145 g，按上述提取方法平行提取，制成样品溶液，在上述色谱条件下在0、4、6、11、17、31 h测定测得羟基红花黄色素A的峰面积，RSD=1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定性好。

2.7 加样回收试验 精密称取样品(西藏自治区藏药厂，批号08038A)6份，分别加入相同量的羟基红花黄色素A对照品，按照上述提取条件进行提取，然后在上述色谱条件下测定，分析数据，计算回收率为93.7%，表明本方法回收率良好。见表1。

表1 加样回收率测定结果 (n=6)

2.9 样品含量 按上述提取和色谱条件[4-7]，对4批次的二十五味绿绒蒿丸进行了含量测定，求得各样品中羟基红花黄色素A的含量，见表2。

表2 样品中羟基红花黄色素A的含量

3 讨论

3.1 前处理方法的选择 根据有关资料分别用3种提取溶剂：甲醇、50%甲醇及25%甲醇各自分别用超声30 min、室温冷浸24 h、加热回流0.5 h提取。按照以上色谱条件对样品进行分析，结果表明加入25%甲醇超声30 min，提取率较高，故选用25%甲醇为提取溶剂，选用超声30 min为提取方法。用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液为供试品溶液。

3.2 流动相的选择 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长402 nm；柱温30℃；流速为1.0 mL/min; 用紫外检测器检测。在此条件下经不同溶剂系统相比较，使用甲醇-0.7%磷酸溶液(30∶70)；乙腈-0.7%磷酸溶液(30∶70)；甲醇-0.7%磷酸溶液(35∶75)；甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(35∶5∶60)等系统研究，发现甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)流动相具有柱压低、峰形和分离度佳及分析时间较短的特点，因此确定流动相采用甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)。

综上，该方法系统适用性、专属性、线性、准确度、精密度、稳定性考察及加样回收方面均符合方法学验证要求。说明本方法测定羟基红花黄色素A含量是准确和可行的。最后以平均含量下浮20%作为本品的含量限度标准，故暂定本品每克含羟基红花黄色素A(C27H32O16)不得少于0.50 mg/g。