影响斑点叉尾 病毒病发病因素的探索

刘洪岩，王江，张世勇，王明华，赵彦华，陈校辉，边文冀

（江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017）

斑点叉尾 病毒（Channel catfish virus,CCV），属于疱疹病毒科（Herpesvirus）， 鱼疱疹病毒属（Ictalurivirus）[1]。CCV 是一种线性双链 DNA 病毒[2]，病毒颗粒为20面体对称，核衣壳由162个壳粒组成，直径约为100nm，具有囊膜的完整病毒粒子，直径约为175～200 nm[3]。CCV基因组全长为134.2 Kb，共有79个开放阅读框。CCV通过滚环方式复制，可发生在10-35℃温度范围内，35℃时复制速度最快，而30℃时复制量最大，最适的复制温度是25-33℃。CCV能够在25℃的池水中生存2 d，在池底淤泥中迅速失活[4]。

斑点叉尾 病毒传播速度快、病程短、病死率高，给斑点叉尾 产业带来了严重的经济损失。在已知的报道中发现，CCV的产生和传播和外部环境有很大的关系，但并没有确定各种影响因子对发病的具体影响力。因此，在目前的预防和治疗措施中，没有提出有效的解决预防方案，只能通过有效的管理来将影响降低。该试验通过对斑点叉尾 攻毒CCV，观察不同的温度、病毒量以及种质对发病以及病死率的影响，旨在为CCVD的防控和斑点叉尾 抗病品种的选育提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验动物

2017年12月从江苏省淡水水产研究所扬中基地6—7月繁育的49个斑点叉尾 家系中随机挑选体质量为15.0～20.0 g的健康幼鱼于江苏省淡水水产研究所实验室内进行暂养2周。暂养期间每天投喂两次，使用嘉吉精养鱼料进行投喂，正式试验开始后停止喂食。使用加热棒将水温控制在28～30℃。

1.2 试验药物

试验用的CCV来自于华中农业大学，试验病毒先配置母液，梯度稀释为103，104，105 TCID50。

1.3 试验方法

试验全程在室内进行，使用容量为250 L的塑料箱进行养殖，试验用水为经过曝气处理的自来水，pH 值7.8～8.2，溶解氧浓度＞5 mg/L，光照 200～1 200 lx，24 h曝气。选择100 g左右，大小均匀的斑点叉尾 进行试验，每组10条。采用腹腔注射的方式进行攻毒，注射病毒体积为100 μL。

病毒浓度影响实验中，设103 TCLD、104 TCLD、105 TCLD 3个浓度组，每组3个平行。温度影响试验中设置两个温度，分别为10℃和18℃，每个组设置3个平行实验。种质影响试验中，设置两种种质，分别为正常的斑点叉尾 和白化的斑点叉尾，每个组设置3个平行试验。温度影响试验中，试验组攻毒的浓度为104 TCLD；种质影响试验中，试验组攻毒的浓度为103 TCLD。对照组同样设置3个平行，注射等量体积的生理盐水。

病毒注射后便开始正式试验，及时观察鱼体活动情况，并记录死亡情况及时捞出死亡个体。死亡标准为触碰无任何反应。

1.4 计算公式

试验结束后按以下公式计算：

累积病死率（cumulative mortality,CM）=（累计死亡鱼尾数/攻毒鱼尾数）×100%

2 结果

斑点叉尾 注射CCV后，观察发现大部分鱼体均出现不同程度的感染现象，前期主要出现鱼集群聚集在角落，部分鱼在水中急促紧张游动，出现打转、翻转现象，最后倒立在水中死亡。体表发现鳍条基部、尾柄、肌肉有出血点，腹腔膨大，单侧或双侧眼球凸出，腮丝发白，表皮发黑。解剖后腹腔内有黄褐色积水，肠道呈现灰白色，肝、脾肿大且有出血点，肾也发现有出血。

2.1 温度对CCVD暴发的影响

斑点叉尾 在注射CCV之后，由于鱼体自身免疫和病毒剂量的关系48 h内没有出现死亡。高温度组（18℃）第3天开始开始出现死亡，低温度组（10摄氏度）第5天出现死亡。高温度组的LC 50出现在第12天，低温度组LC50出现在第13天，在第13天之后，高温度组和低温度组没有明显差异，高温度组在17 d全部死亡，低温度组在18 d全部死亡。至试验结束，对照组全部存活。试验结果如图1所示。

图1 不同温度组斑点叉尾累积病死率和累计病死数目

2.2 病毒浓度对CCVD暴发的影响

斑点叉尾 在注射CCV 20 h之后，105TCLD出现死亡，104TCLD组在攻毒后3 d出现死亡，103TCLD组在第8天才出现死亡。103组第八天开始出现了暴发性死亡，从开始死亡到全部死亡，用时10 d，与104TCLD和105TCLD接近。103TCLD，104TCLD，105TCLD组的LC50分别出现在第13天，第12天和第10天。试验结果如图2所示。

2.3 种质浓度对CCVD暴发的影响

为了突出种质的区别，试验中选取了正常的斑点叉尾 和白化斑点叉尾 作了对比试验。白化组在第3天开始出现暴发性死亡，病程短，从出现死亡到全部死亡用时4 d，正常组在第8天开始出现死亡，病程较长，全部死亡用时10 d。103TCLD攻毒时，正常组的LC50出现在第10天，白化组的LC50出现在第5天。实验结果如图3所示。

3 讨论

该试验讨论了温度，病毒浓度和种质对CCVD暴发的影响。

图3 不同种质组斑点叉尾累积病死率和累计病死数目

在温度的试验中，10℃组和18℃组在暴发的时间上时有区别的，低温组暴发迟缓。两组实验中，从暴发到死亡所用的时间，也就是病程，并无很大区别，低温组用时13 d，高温组用时15 d。这说明，温度会影响病毒的复制，温度升高会加快病毒的复制，但是，当病毒达到一定的浓度时，温度这一因子对疾病的暴发影响力并不大。与以往的研究不同，该次试验中，在10℃的试验组发现了CCVD的暴发，这说明在低于15℃时，CCVD是可能暴发的。

在观察浓度对CCVD的暴发的影响时，发现，低浓度组（103）暴发最晚；高浓度组（105）最先暴发。这证明，病毒在鱼体内达到一定的量，才会对鱼造成伤害，CCVD暴发的时候，鱼体内的病毒已经达到了一定浓度。高浓度的病毒作用下的是急性病毒病感染，个体免疫系统不能迅速地将所有的病毒清除，因此，短时间内会出现较多的死亡，但是，由于个体差异，有些个体免疫反应比较强，对病毒清除比较快，因此不会在短时间内一下都发病[5]。低浓度的病毒感染是慢性感染，病毒感染后，宿主有时间修复病毒造成的组织损伤，因此CCVD暴发需要长时间的病毒复制才能实现，所以出现了暴发推迟，但是暴发的病程并没有延长，这是因为病毒在宿主体内存在并不断复制，发病时已经达到了高浓度，并且由于慢性的病毒感染，已经导致了部分器官的病变，因此病程不会延长。

种质对CCVD暴发影响的试验证明，种质在对抗疾病中起到关键性作用。试验中使用了白化的斑点叉尾 ，在低浓度作用下，会迅速暴发引起死亡（第3天暴发VS正常组第8天暴发），病程极短（白化组病程4 dVS正常组病程10 d）。这说明，种质对CCVD暴发有很大的影响。种质的差异，区别于个体的差异，是一种群体的表现，白化群体表现出来对CCVD抗性非常弱。这也说明了选育抗病品质的必要性和可行性。

综合目前国内外的相关研究可以发现，CCV是一种传播速度极快、危害十分严重的急性传染病。感染后的致死率甚至能够超过90%达到100%。大规模的暴发CCV将会给养殖产业带来极其严重的经济损失。目前常用的CCV检测手段主要是通过细胞培养的方式分离病毒，然后使用免疫荧光或PCR分子鉴定的方法来进行检测，但操作步骤过于繁琐且周期较长[6-7]。李惠芳等人建立的实时荧光定量PCR检测方法则大大提高的检测速率和准确性[8]。

在目前的技术条件下还没有有效的治疗方法来控制CCV，只能通过合理高效的管理手段来降低发病风险。从而将损失压到最低。

首先要定期对养殖场环境进行检疫，尤其是苗种的产地检疫。由于CCV是可以垂直传播的，并且在病毒积累到一定量才会发病，因此，携带者就是暴发的危险因子。一旦发现有携带CCV，应该及时清除。其次，消毒，减少环境对鱼的应激，苗种孵化一定要采取消毒措施，对于已经感染病毒的苗种要及时清除，使用的工具也要进行销毁。最后是新品种的培育。种质在抗病中起到关键作用，不同的种质对于疾病的敏感性不同，例如抗病基因的筛选（干扰素高表达品种），抗病SNP筛选等等[9]。因此，选育抗病新品种是预防CCVD暴发的关键[10]。