毒死蜱对斑马鱼的急性毒性试验

霍奕安，胡秀彩，吕爱军，孙敬锋

（1.天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点试验室，天津300384；2.天津农学院，创新创业试验室，天津300384）

斑马鱼（Danio rerio）又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼等，是一种热带观赏鱼体长4～6 cm，胚胎透明且体外发育，易于活体观察，生长发育快[1]。因此已经成为生命科学中对疾病，遗传和毒理学的理想模式生物[2]。随着人类社会的迅速发展，工业上产生的各种废弃物，如重金属，工业污水，农业上产生的农药、消毒液残留等有害物质通过雨水冲刷，或者直接向农田施肥等途径对土壤、鱼类等产生了严重的影响，并且直接威胁到人类健康。目前，国内关于鱼类急性毒性的试验研究，经常以鲤、金鱼作为试验对象，斑马鱼还未被广泛地应用于药物毒理学的研究[1-2]。近几年，斑马鱼可作为监测药物靶器官的有效模型，而毒死蜱对于水生生物的急性毒性研究相对较少[3-6]。我国目前农药年产量已达到80万t，居于世界第2位[7-9]。毒死蜱是一种广谱高效的有机磷杀虫、杀螨剂，具有触杀、胃毒和熏蒸作用，对鱼类和水生生物毒性较高毒[10-11]。该试验采用农药毒死蜱对斑马鱼进行急性毒性试验，获得了毒死蜱对斑马鱼的基础毒理学数据，为水产养殖和鱼病防治等提供了数据参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

斑马鱼购于天津市某花鸟市场，平均体长3.9 cm，平均体质量0.44 g。毒死蜱（有效成分含量40%，规格300 g，乳油剂型），购自湖北仙隆化工股份有限公司。

1.2 试验方法

参照吕爱军等[12]试验方法进行，采用静水法进行急性毒性试验。斑马鱼试验前在室内驯养5 d以上，其自然病死率小于1%，试验前1 d停止投喂饲料，在试验期间不喂食。培养箱温度为（25±2）℃，光照/黑暗为12 h/12 h。以毒死蜱配制7个不同浓度系列，并设1个空白对照，每个浓度及对照组随机放入10尾斑马鱼。试验开始后连续观察8 h，并观察和记录鱼的中毒情况（呼吸、反应、平衡、游动、体色变化）及96 h内的死亡情况和开始死亡时间与死亡数目。当出现鱼死亡时，及时捞出，以免污染水质，观察记录鱼体表特征与内脏表面特征。试验时间是96 h，96 h后如果仍有活鱼，则继续试验至7 d。

1.3 数据处理

试验数据分析采用的是Bliss法来计算斑马鱼的半致死浓度LC50，安全质量浓度用公式为

病死率=死亡试验鱼数/试验鱼总数×100%。

2 结果

2.1 斑马鱼急性毒性试验结果

毒死蜱对斑马鱼急性毒性试验发现，毒死蜱质量浓度为1.3 mg/L时，5 h后有1条开始出现失衡，偶尔急速窜游现象，12 h内试验鱼出现死亡，死亡1条，鳃部有明显出血现象，至24 h病死率为20%，到48 h已经死亡70%，24～48 h是斑马鱼的集中死亡时段；毒死蜱质量浓度达到1.4 mg/L时，72 h内斑马鱼病死率达到100%；毒死蜱质量浓度为1.5 mg/L时，7 h内试验鱼身体出现明显折弯现象，鳃部均有不同程度的出血，至12 h死亡6条，至48 h全部死亡。毒死蜱质量浓度低于1.0 mg/L时，1周后仍有试验鱼存活。各组的试验鱼7 d时的病死率相比于96 h，在质量浓度为0.9 mg/L和质量浓度为1.0 mg/L时出现变化，分别病死率从50%上升至80%、60%上升至90%。当毒死蜱质量浓度为0.6 mg/L时，未出现试验鱼死亡，说明此时毒死蜱对斑马鱼的毒性作用比较小（表1）。

表1 毒死蜱对斑马鱼急性毒性作用（病死率） %

2.2 斑马鱼中毒表现及死亡特征

毒死蜱对斑马鱼中毒较快，反应比较强烈。在低浓度梯度试验中，斑马鱼刚开始放入时，一般都出现较为激烈的急速蹿游现象，但随后会消失，消失的时间长短与浓度有关。适应试验环境后，鱼群积极游动，偶尔会有集群现象，既而出现上浮、顶水、尾略下垂等现象。但是随着中毒程度的愈来愈深，试验鱼出现抽筋，时而翻肚、时而垂直于水面等失衡现象，或者沉于水底，并且呼吸加快加重或弓背，身体出现明显折弯现象，渐渐地游动能力减弱甚至丧失、反应迟钝、沉于水底，几乎都会出现腮部出血直至死亡。

在高浓度梯度试验中，斑马鱼在开始受药的短短2～5 h中，出现强烈的急速窜游，严重失衡挣扎现象，甚至跃出水面。试验鱼短时间内鳃部出现明显出血，继而在水中打转，直至死亡，身体有很明显的折弯现象。高质量浓度组相比于低质量浓度组从斑马鱼受试中毒到死亡的间隔时间变短，中毒现象也更加明显。

2.3 LC50值及质量安全浓度（SC）

经过统计学分析，计算毒死蜱半致死浓度和质量安全浓度值见表2。试验结果表明，毒死蜱的安全质量浓度为0.209 mg/L。参照GB/T 21281—2007我国化学物质对鱼类毒性分级标准（96 h LC50≤1.0 mg/L时为急性毒性Ⅰ级，1.0 mg/L≤96 h LC50≤10.0 mg/L为急性毒性Ⅱ级，10.0 mg/L≤96 h LC50≤100.0 mg/L为急性毒性Ⅲ级）[13]。毒死蜱的96 h LC50为0.926 mg/L，由此判定毒死蜱对斑马鱼的急性毒性为Ⅰ级。根据《化学农药环境安全评价试验准则》[14]中农药对鱼类的毒性等级划分（剧毒，96 h LC50≤0.1 mg/L；高毒，96 h LC50≤1.0 mg/L；中毒，1.0 mg/L＜96 h LC50≤10.0mg/L；低毒，96 h LC50＞10.0 mg/L），可判定敌敌畏对斑马鱼为高毒。

表2 斑马鱼的LC50和SC

3 讨论

近几年，斑马鱼可作为监测药物靶器官的有效动物模型，而毒死蜱对于水生生物的急性毒性研究相对较少[3-6]。赵于丁等[15]报道10种农药对斑马鱼的毒性与安全评价中，涉及到毒死蜱对于斑马鱼的毒性研究，结果显示毒死蜱对于斑马鱼的24、48、72和96 h的半致死浓度分别为0.7943、0.7332、0.6434和0.5184 mg/L，并且斑马鱼对于毒死蜱的中毒症状为先兴奋，后游动迟缓或困难，得出的结果判定毒死蜱对斑马鱼为高毒。在该试验中，毒死蜱对斑马鱼的安全质量浓度为0.209 mg/L，斑马鱼24、48、72和96 h的半致死浓度较高，这可能与斑马鱼品系、季节和气温等有关。斑马鱼对于毒死蜱的中毒症状相对一致，而且判定毒死蜱对斑马鱼均为高毒，可以为水产养殖和鱼病防治提供相对有价值的参考数据。

马军国等[16]通过毒死蜱对于尖膀胱螺的急性毒性试验发现，毒死蜱对尖膀胱螺24、48、72和96 h时的半致死浓度分别是0.577 mg/L、0.308 mg/L、0.243 mg/L和0.160 mg/L以及安全质量浓度为0.016 mg/L，显示毒死蜱对于螺类的毒性要大于斑马鱼。马继华等[17]报道毒死蜱对于南美白对虾的急性毒性影响，结果表明对南美白对虾24、48、72和96 h 的半致死浓度分别为 3.44 μg/L、2.08 μg/L、1.36 μg/L和0.89 μg/L以及安全质量浓度为0.0089 μg/L，可见毒死蜱对于虾类的毒性更加高。已有报道南美白对虾表现出来的中毒症状有狂游和冲撞，在水中打转；或者上下直窜，急速游动。持续一段时间之后，体色开始变白变淡，逐渐丧失游泳功能，失去平衡，躺卧在水底。南美白对虾在高浓度梯度试验组中的中毒反应很迅速，在短时间内全部个体都出现明显的中毒症状；而在低浓度试验组中，则要经过很长时间之后才有个别受试虾出现异常的症状。这与毒死蜱对于斑马鱼的中毒现象非常相似，尤其体现在鱼体色变淡，出现急速窜游和失衡等现象。

该研究结果表明，毒死蜱对斑马鱼的急性毒性为Ⅰ级，对斑马鱼的毒性等级为高毒。毒死蜱的安全质量浓度为0.209 mg/L，因而毒死蜱对于斑马鱼的毒性较为强烈，不是斑马鱼的安全药物，不建议用来作为杀灭寄生虫渔药，在水产养殖中需要谨慎使用。