新型胶颗粒芯片技术检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的研究

苏丹 李强 车南颖 欧喜超 赵冰 赵雁林 黄海荣

结核病(TB)是全球第九大致死疾病，是由结核分枝杆菌复合群(MTBC)引起的一种严重危害人类健康的传染性疾病。据世界卫生组织[1]报告仅2016年全球就有1040万例新发肺结核患者，其中有49万例耐多药结核病患者，耐多药结核病仍然是全球重大公共卫生危害之一。因此，及早正确诊断结核病及耐多药结核病对于治疗和预防这种高度传染性疾病具有非常重要的意义。

传统的细菌学检查方法如萋-尼(Z-N)染色镜检的敏感度较低(60%)[2]，容易对患者造成漏诊；BACTEC MGIT 960快速液体培养系统(简称“MGIT 960”)液体培养试验需要1～2周的时间才能报告结果，同时液体培养试验对实验室硬件和人员能力也都有较高的要求[3-4]，限制了该方法的广泛推广应用。通过传统的培养技术检测结核分枝杆菌耐药性，耗时较长(约2～3个月)，不能满足临床医生对患者及时诊断、早期合理治疗的需要。近些年随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的分子检测技术可有效检测痰标本中的结核分枝杆菌及其耐药性，检测方便快捷且敏感度较高。新型胶颗粒芯片为低密度胶颗粒芯片，突破了一般芯片二维界面的局限性，通过提供三维反应空间，使得在新型胶颗粒芯片上可以进行更加有效的分子间反应，同时每个胶颗粒里可以装载不同的反应试剂，更加灵活[5-6]。新型胶颗粒芯片技术[TruArray胶颗粒芯片(Gel element arrays)，简称为“TruArray芯片”]用于结核分枝杆菌耐药性检测，通过检测最常见的rpoB和katG/inhA耐药基因是否突变，确定结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性，可以在6 h内自动报告检测结果[7]。本研究通过该方法检测149例疑似肺结核患者痰标本，检测是否含有结核分枝杆菌及其对利福平和异烟肼的耐药性，初步分析该技术的检测效能，探讨其在我国临床结核病实验室的推广应用价值。

对象和方法

一、研究对象和试剂

1．研究对象：选取2016年8月在首都医科大学附属北京胸科医院就诊的所有疑似肺结核患者，共149例，提供149份痰标本。

2. 试剂：TruDx 2100 试剂盒购自美国Akonni公司，GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)试剂盒购自美国Cepheid公司，MGIT 960液体培养管和药物敏感性试验(简称“药敏试验”)检测试剂盒均来自美国BD公司。

二、研究方法

1．痰标本处理：痰标本采用N-乙酰-L半胱氨酸-NaOH(NALC-NaOH)消化液处理，使用磷酸盐缓冲液中和并离心(3000×g、8～10 ℃ 离心15～20 min)后，倾倒磷酸盐缓冲液并重悬菌液沉淀至2 ml，分装2份分别进行MGIT 960快速液体培养和GeneXpert检测。

2．MGIT 960培养法和药敏试验：加入0.5 ml处理后的痰标本至MGIT 960培养管(含0.8 ml OADC营养添加剂和抑菌剂)中进行培养，孵育42 d，实时监测并读取结果[3-4]。对培养阳性鉴定为MTBC的菌株，按照操作手册要求将其加入含有利福平(1 μg/m1)和异烟肼(0.1 μg/m1)药物的培养管中，进行利福平和异烟肼的耐药性检测[8-9]。

3. GeneXpert检测：将GeneXpert试剂盒配套的处理液加入到含有NALC-NaOH处理后痰标本的离心管中，涡旋振荡后静置15 min，将处理后样品由加样孔缓慢加入到反应盒内。然后上机，反应2 h后读取结果[8,10]。

4．TruArray芯片检测：使用TruTip纯化装置和TruPrep自动化样本制备仪(Akonni Biosystems)进行核酸提取和纯化，每次运行能够同时处理8个样品。取40 μl液化缓冲液加入到500 μl痰标本中并在56 ℃的水浴中加热20 min，将液化的样品转移到样品裂解管，随后将样品裂解管放入自动化样本制备仪，通过软件启动程序运行，核酸提取自动完成后，吸取16.8 μl DNA与63.2 μl制备的MTB多重PCR反应液(Akonni)混合，然后将装载的微阵列置于Bioer GeneTouch平板热循环仪(杭州博日科技有限公司)上，并进行以下扩增和杂交程序：30个循环的降落PCR(第1个循环，89 ℃变性45 s，60 ℃退火1 min，第30个循环为55 ℃退火)，在65 ℃进行30 s延伸，20个循环的PCR(89 ℃变性45 s，55 ℃退火60 s和65 ℃延伸30 s)，最终55 ℃杂交3 h。杂交后，用1000 μl杂交洗涤缓冲液洗涤微阵列，然后离心(200×g、离心1 min)以干燥微阵列。使用具有自动软件分析的TruDx®成像仪对干燥的微阵列成像，仪器自动报告结果。

5．测序：采用16S rRNA基因测序对液体培养阳性菌株进行结核分枝杆菌菌种鉴定，rpoB基因测序用于利福平耐药基因检测，katG和inhA基因测序用于异烟肼耐药基因检测。扩增产物由天一辉远生物技术有限公司进行单向测序，序列提交至美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站(http://blast.Ncbi.nlm．nih．gov/Blast.cgi)做同源性比较或多序列比对，引物序列见表1。

表1 菌种鉴定及耐药基因测序引物序列

三、统计学处理

采用SPSS 22.0软件对结果数据进行统计学处理，计算敏感度和特异度，评价新型胶颗粒芯片技术检测对结核分枝杆菌、利福平和异烟肼耐药性的检测效能。各种检测方法的检出率比较采用配对卡方检验(McNemar test)，以P<0.05为差异有统计学意义。通过Kappa一致性检验，对TruArray芯片与耐药基因测序检测利福平和异烟肼耐药的一致性进行比较，Kappa值>0.75代表一致性好。

结 果

一、MGIT 960液体培养、GeneXpert和TruArray芯片对结核分枝杆菌检出率的比较

149份痰标本中，54份标本MGIT 960液体培养阳性，6株培养阳性菌株经测序鉴定为非结核分枝杆菌(5株为胞内分枝杆菌，1株为堪萨斯分枝杆菌)，液体培养对结核分枝杆菌的阳性检出率为32.2%(48/149)；81份标本GeneXpert结核分枝杆菌检测阳性，1份GeneXpert检测阳性标本经测序鉴定为胞内分枝杆菌，GeneXpert对结核分枝杆菌的阳性检出率为53.7%(80/149)；86份标本TruArray 芯片结核分枝杆菌检测阳性，1份TruArray 芯片检测阳性标本经测序鉴定为胞内分枝杆菌，TruArray芯片对结核分枝杆菌的阳性检出率为57.0%(85/149)。TruArray芯片和GeneXpert两种方法阳性检出率差异无统计学意义(χ2=0.34，P=0.560)，但TruArray芯片检测阳性检出率高于液体培养(χ2=18.59，P<0.01)。

二、 TruArray芯片对痰标本中结核分枝杆菌的检测

以MGIT 960液体培养联合测序鉴定结果为标准，TruArray芯片检测痰标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为97.9%(47/48)和61.4%(62/101)。以GeneXpert检测联合测序结果为标准，TruArray芯片检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为97.5%(78/80)和88.4%(61/69)(表2)。

三、 TruArray芯片检测痰标本中结核分枝杆菌对利福平的耐药性分析

共对48株分离的结核分枝杆菌菌株进行MGIT 960液体药敏试验，5份标本TruArray芯片利福平耐药检测失败，以液体药敏试验结果为标准，TruArray芯片检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为91.7%(11/12)和96.8%(30/31)。81份GeneXpert检测阳性标本，2份标本GeneXpert利福平耐药检测失败，11份标本TruArray芯片利福平耐药检测失败，以GeneXpert检测结果为标准，TruArray芯片检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为85.0%(17/20)和97.9%(47/48)。对43株分离培养的结核分枝杆菌菌株进行rpoB耐药基因测序，与测序结果比较，TruArray芯片检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为92.3%(12/13)和100.0%(30/30)(表3)，TruArray芯片利福平耐药检测与rpoB耐药基因测序结果的一致性较高(Kappa值=0.9)。

表2 TruArray芯片检测MTB的效能

注敏感度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%；特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%

表3 TruArray芯片检测MTB对利福平耐药的效能

注敏感度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%；特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%

四、 TruArray芯片检测痰标本中结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性分析

共对48株分离的结核分枝杆菌菌株进行液体药敏试验，2份标本TruArray芯片异烟肼耐药检测失败，以液体药敏试验结果为标准，TruArray芯片检测异烟肼耐药的敏感度和特异度分别为78.6%(11/14)和93.8%(30/32)。对46株分离培养的结核分枝杆菌菌株进行katG和inhA耐药基因测序，与测序结果比较，TruArray芯片检测异烟肼耐药的敏感度和特异度分别为100.0%(11/11)和94.3%(33/35)，TruArray芯片异烟肼耐药检测与katG和inhA耐药基因测序结果的一致性较高(Kappa值=0.9)(表4)。

讨 论

目前，越来越多的新检测技术可进行结核病及耐药结核病的早期诊断和鉴定，每种检测技术各有利弊[11-12]。本研究评估的新型胶颗粒芯片技术，通过使用自动化核酸提取方法，将常规的核酸提取步骤(裂解、吸附、洗脱)整合在一个吸头上，4 min内完成DNA核酸样品的快速提取，操作简单方便。通过使用全自动移样器还可进行核酸样品的批量提取，实现样品准备工作的快速和自动化[13]。TruArray芯片中的每个胶颗粒都是一个独立的生物传感器并能支持独立的化学反应，并在密封芯片内集成了扩增、杂交、洗脱、荧光读取等功能。由于芯片的密封性和高集成性，降低了扩增产物污染，保证结核分枝杆菌及耐药检测结果准确可靠。本研究结果表明，TruArray芯片对痰标本中结核分枝杆菌的检出率高于液体培养试验，以液体培养试验联合测序鉴定结果为标准，TruArray芯片检测结核分枝杆菌的特异度仅为61.4%。由于TruArray芯片以及GeneXpert检测和其他分子检测一样，仅能检测结核分枝杆菌的DNA，检测阳性不能区分是活菌还是死菌，但液体培养阳性能证明标本中有活菌存在；本研究液体培养阳性率较低，可能由于笔者使用冻存的痰标本，降低了分离培养的阳性率。

表4 TruArray芯片检测MTB对异烟肼耐药的效能

注敏感度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%；特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%

GeneXpert检测是世界卫生组织推荐的结核分枝杆菌分子生物学检测方法，有大量研究表明该方法可以简单快速地诊断结核病及利福平耐药结核病[10]。本研究证明，TruArray芯片与GeneXpert检测效能相当，实验中发现1份GeneXpert结核分枝杆菌检测阳性标本经测序鉴定为胞内分枝杆菌，GeneXpert检测结果为极低，利福平耐药检测结果为敏感；另有1份TruArray芯片结核分枝杆菌检测阳性标本经测序鉴定也为胞内分枝杆菌，利福平和异烟肼耐药检测失败，两份标本均涂片镜检阳性，推测可能是由于所检样本为结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌混合感染，但胞内分枝杆菌所占比例较高且报告时间较早，导致培养试验仅分离出胞内分枝杆菌所致。

对于TruArray芯片结核分枝杆菌检测阳性的标本，还可进一步检测其对利福平和异烟肼的耐药性，而目前GeneXpert检测仅能对利福平的耐药性进行检测，以液体药敏试验结果为标准，TruArray芯片检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为91.7%和96.8%，与耐药基因测序结果比较，TruArray 芯片检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为92.3%和100.0%， TruArray芯片利福平耐药检测与rpoB耐药基因测序结果的一致性较高。以液体药敏试验结果为标准，TruArray芯片检测异烟肼耐药的敏感度和特异度分别为78.6%和93.8%，造成敏感度较低的原因，可能是由于该检测方法仅检测两个主要的异烟肼耐药相关基因，分别是katG和inhA基因，这2个基因与异烟肼耐药相关性仅为70%左右[14]，通过与耐药基因测序结果比较，检测敏感度和特异度分别为100.0%和94.3%。同时，本研究发现目前TruArray芯片检测利福平耐药的失败率较高(18.6%,16/86)，为进一步提升TruArray芯片检测结果的稳定性及异烟肼耐药检测的敏感度，还需要进一步优化反应体系并增加相关异烟肼耐药基因的检测。

综上所述，TruArray芯片检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度较高、检测周期短、操作相对简单，同时可以准确检测利福平和异烟肼的耐药性，对结核病、尤其是耐多药结核病的早期诊断和治疗具有十分重要的意义。