宫颈病变患者TWIST与E-Cadherin表达水平的相关性分析

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(1.成都市郫都区人民医院妇产科，四川 成都 611730；2.成都医学院第一附属医院妇产科，3.成都医学院第一附属医院病理科；4.成都市郫都区人民医院病理科)

宫颈癌是一种临床常见妇科恶性肿瘤，发病率仅低于乳腺癌，是妇科恶性肿瘤致死的主要原因，自宫颈液基薄层细胞学检查(Thinprep Liquid-based Cytology test, TCT)筛检及人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)检测技术应用以来，大大提高了宫颈癌前病变及宫颈癌的早期诊断率，及时治疗后，病死率得到了有效控制[1-2]。但随着近年来社会结构和人们生活方式的改变，其发病率逐渐呈年轻化趋势，关于其复杂发病机制的研究依旧是目前临床广泛关注的热点。TWIST蛋白是一种主要在胚胎中胚层及胎盘等组织中表达的高度保守的转录因子，胎儿出生后表达水平显著降低，在诱导细胞分化及迁移中具有重要调控作用。研究发现，TWIST是一种在多种恶性肿瘤中高表达的原癌基因，与肿瘤细胞凋亡、血管生成及肿瘤抗药性密切相关，同时还具有诱导肿瘤浸润转移的作用，学者认为可将其作为恶性肿瘤预后及治疗的新的靶点[3]。E-钙黏蛋白(E-Cadherin)是一种参与了Ca2+依赖性细胞黏附生理过程的跨膜糖蛋白。上皮性肿瘤疾病进展过程中可观察到不同程度的E-Cadherin丢失或功能抑制，且E-Cadherin可能与肿瘤分化及临床分期具一定相关性[4]。截止目前，已在食管鳞癌、乳腺癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤中发现有TWIST与E-Cadherin的异常表达[5-6]，然而关于其在宫颈癌中的研究鲜有报道。本研究通过检测TWIST与E-Cadherin在宫颈癌中的表达水平，并结合宫颈癌临床病理因素综合分析，探究其表达水平的相关性及其在宫颈癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1标本来源①宫颈癌组：收集2014年7月至2017年6月于本院行广泛性全子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术治疗患者的完整宫颈癌标本74例，均经术后病理检查确诊宫颈癌。患者年龄30～62岁，平均47.1岁，术前均未接受放疗及化疗，排除合并恶性肿瘤、妇科严重感染性疾病及妊娠期患者，半年内无子宫颈治疗史及子宫内膜异位病史。②宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)组：收集同期于本院行Leep手术切除/阴道下活检的完整CIN标本35例。③正常宫颈组：收集同期与本院因子宫肌瘤行子宫全切术治疗的正常宫颈组织22例。入组研究的患者术后病理组织经石蜡固定标本后，均经免疫组化染色处理，由2名经验丰富的病理专家审查后做出统一的病理临床诊断，并获取患者年龄、组织类型、临床分期等临床资料。

1.2方法

1.2.1 主要实验试剂 兔抗人TWIST多克隆抗体(北京博奥森生物有限公司)，兔源性二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，SP试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2.2 标本处理 常规组织标本取材后，石蜡固定，低温-20℃保存冷冻10min；连续切片4张，厚度约为4μm，置于烤箱中烘干后，将切片浸入二甲苯中10min×2次，无水乙醇中2min×2次，90%乙醇中2min×2次，80%乙醇中2min×2次，常规脱蜡至水化；使用3%过氧化氢孵育15min，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗3min；PBS缓冲液(PH7.0)冲洗5min，冲洗3次。用微波炉行抗原修护，高温高压160℃煮沸后持续3min，自然冷却至室温，滴加兔源性一抗，4℃冰箱中过夜；室温下复温，PBS冲洗5min，冲洗3次；兔源性二抗，室温下孵育30min，PBS冲洗5min，冲洗3次。应用DAB显色，显色时间约4min；苏木素复染1min，自来水冲洗15min；浸入80%乙醇中5min×1次，90%乙醇中5min×1次，无水乙醇中5min×1次，无水乙醇中10min×1次，二甲苯10min×3次，依次浸泡脱水，切片风干后中性树胶封片，光学显微镜下观察。以PBS代替一抗做阴性对照。

1.2.3 结果判定 光学显微镜下可观察到细胞核和细胞质中出现淡黄色或黄褐色染色即可判定为TWIST阳性，观察到细胞膜和(或)细胞质中出现棕黄色染色即可判定为E-Cadherin阳性。根据光学显微镜下可观察到的染色强度将其分为阴性(-)、弱阳性(+)、中等阳性(++)及强阳性(+++)。

1.3统计学方法应用SPSS19.0软件处理数据，计数资料采用χ2检验或Fisher精确概率法检验；采用Spearman相关性分析TWIST与E-Cadherin表达水平之间的关系。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 TWIST在不同类型宫颈组织中的表达及其与宫颈癌临床病理的关系在正常宫颈、CIN及宫颈癌组织中的细胞核内TWIST表达水平较高，细胞质可观察到少量表达。TWIST在正常宫颈、CIN及宫颈癌组织中的阳性表达率为18.18%、37.14%、72.97%，三组间比较差异具有统计学意义；TWIST在宫颈癌组织中的阳性表达率显著高于其在正常宫颈、CIN组织中的表达，TWIST在正常宫颈及CIN组织中的阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。TWIST在宫颈癌中的阳性表达率与患者不同年龄、不同组织类型、不同临床分期、不同分化程度及不同肿瘤大小间的差异比较无统计学意义(P>0.05)；TWIST在宫颈癌间质浸润深度≥1/2的患者宫颈癌组织中的阳性表达率显著高于宫颈癌间质浸润深度<1/2的患者，TWIST在发生淋巴结转移的患者宫颈癌组织中的阳性表达率显著高于未淋巴结转移的患者。见表2。

表1 TWIST在不同类型宫颈组织中的表达(例)

与正常宫颈组比较，aP<0.05；与CIN组比较，bP<0.05。

表2 TWIST的表达与宫颈癌临床病理的关系(例)

2.2 E-Cadherin在不同类型宫颈组织中的表达及其与宫颈癌临床病理的关系E-Cadherin在正常宫颈、CIN及宫颈癌组织中的阳性表达率分别为77.27%、60.00%、39.19%，三组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)；与正常宫颈、CIN组相比，E-Cadherin在宫颈癌组织中的阳性表达率显著降低，在正常宫颈及CIN组织中的阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。E-Cadherin在宫颈癌中的阳性表达率与患者不同年龄、不同组织类型、不同临床分期、不同分化程度及不同肿瘤大小间的差异比较无统计学意义(P>0.05)；E-Cadherin在宫颈癌间质浸润深度≥1/2的患者宫颈癌组织中的阳性表达率显著低于宫颈癌间质浸润深度<1/2的患者，E-Cadherin在发生淋巴结转移的患者宫颈癌组织中的阳性表达率显著低于未淋巴结转移的患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表3 E-Cadherin在不同类型宫颈组织中的表达(例)

与正常宫颈组比较，aP<0.05；与CIN组比较，bP<0.05。

表4 E-Cadherin在宫颈癌中的表达与宫颈癌临床病理的关系(例)

2.3 TWIST与E-Cadherin表达水平的相关性分析Spearman相关性分析结果显示，TWIST与E-Cadherin在宫颈癌组织中表达水平呈显著负相关关系(r=-0.511,P<0.05)。见表5。

表5 TWIST与E-Cadherin在宫颈癌组织中表达水平的相关性分析(例)

3 讨 论

细胞凋亡是指机体为维持内环境稳定，通过基因控制细胞自助死亡的主动生理过程，涉及多种基因的激活、表达及调控等方面作用影响。而细胞增殖及细胞凋亡失衡是导致恶性肿瘤发病的主要原因，同时亦是恶性肿瘤的基本特征之一[7]。近年来，人们认为TWIST是一种具有编码抗凋亡蛋白及抑制肿瘤细胞凋亡作用的原癌基因，其表达水平上升可导致恶性肿瘤发生风险增加[8]。本研究结果发现，TWIST在正常宫颈及CIN组织中的表达主要为阴性及弱阳性，在宫颈癌组织中的表达主要为中度阳性及强阳性，且TWIST在宫颈癌组织中的阳性表达率显著高于其在正常宫颈、CIN组织中的表达，TWIST在正常宫颈及CIN组织中的阳性表达率比较无显著差异。提示CIN虽具有较高的恶性转化可能，但仍处于癌前病变阶段，也可能与宫颈癌的发生发展有关。

本研究分析TWIST的表达与宫颈癌临床病理的关系，结果显示，TWIST在宫颈癌中的阳性表达率不受患者年龄、组织类型、临床分期、分化程度及肿瘤大小影响，而是受宫颈癌间质浸润深度及是否发生淋巴结转移影响，宫颈癌间质浸润深度≥1/2及发生淋巴结转移的患者TWIST阳性表达率显著较高。肿瘤细胞浸润和转移一直是恶性肿瘤临床治疗工作中的难点问题之一，也是导致患者死亡的重要原因，是受多种因素共同影响作用的复杂生物学进程。研究发现，TWIST可通过促进侵入性伪足的高表达，使其发挥降解细胞外基质的作用，帮助肿瘤细胞侵入周围组织[9]。在乳腺癌研究中发现，TWIST具有促进VEGF表达的作用，可促进新生血管生成，增加染色体不稳定性，从而起到促进肿瘤细胞浸润转移的作用[10]。另外，TWIST的表达还与宫颈癌的预后效果相关，宫颈癌中有淋巴结转移的患者5年内生存率显著低于无淋巴结转移的患者，淋巴结转移数目越多，其生存率越低[11]。由于淋巴结转移作为宫颈癌患者预后不良的主要原因之一，提示可将TWIST的阳性表达率作为评价宫颈癌患者预后效果的参考指标之一，但本研究中尚未进行生存率方面的比较分析，仍有待进一步深入探究。

E-Cadherin是一种广泛存在于人与动物上皮细胞中的单次跨膜钙依赖性糖蛋白，具有维持上皮细胞完整性的重要作用。当E-Cadherin丢失或功能被抑制时，可导致细胞间粘附力降低，增加细胞浸润转移风险。现有研究中多认为E-Cadherin是一种经典的肿瘤抑制蛋白，其表达水平降低与胃癌、结直肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[12-13]。本研究结果发现，E-Cadherin在正常宫颈及CIN组织中的表达主要为中度阳性及强阳性，在宫颈癌组织中的表达主要为阴性及弱阳性，且TWIST在宫颈癌组织中的阳性表达率显著低于其在正常宫颈、CIN组织中的表达，TWIST在正常宫颈及CIN组织中的阳性表达率比较无显著差异。其原因可能是CIN属于低级别的上皮内瘤变，其细胞形态与炎症性及不典型性细胞较为相似，且大多数CIN患者病情可自行消退恢复正常，不属于肿瘤性病变[14]，提示E-Cadherin表达水平降低可能具有促进宫颈癌发生的作用。另外，本研究结果也显示，E-Cadherin在宫颈癌中的阳性表达率不受患者年龄、组织类型、临床分期、分化程度及肿瘤大小影响(P>0.05)，而是受宫颈癌间质浸润深度及是否发生淋巴结转移影响(P<0.05)，宫颈癌间质浸润深度≥1/2及发生淋巴结转移的患者E-Cadherin阳性表达率显著较低，提示E-Cadherin表达水平降低可能具有促进宫颈癌浸润转移的作用，且TWIST与E-Cadherin在宫颈癌组织中表达水平呈显著负相关关系(r=-0.511,P<0.05)，TWIST阳性表达组织中的E-Cadherin阳性表达率显著低于TWIST阴性表达组织，且随着宫颈癌的发生发展，TWIST阳性表达率逐渐上升，E-Cadherin阳性表达率逐渐降低，提示TWIST与E-Cadherin在宫颈癌的发生发展中二者相互影响，可能具有拮抗作用。其机制可能是TWIST可作用于E-Cadherin启动因子上的E-boxes序列，抑制E-Cadherin的表达，从而降低细胞粘附率，促进膀胱癌等恶性肿瘤的浸润转移[15]。本研究仍存在一些不足之处，如：尚未进行TWIST与E-Cadherin表达与宫颈癌患者预后生存率的分析，有待进一步随访。

综上所述，TWIST在宫颈癌的发生发展中表达水平显著上升，且与间质浸润深度及发生淋巴结转移密切相关，可能具有促进宫颈癌发生及肿瘤细胞浸润转移的作用，其作用机制可能与TWIST能抑制E-Cadherin的表达相关。