北芪五加颗粒长期毒性试验研究

赵留涛 ，吴洪银，吴冠连，陈五常，徐洪德，袁之润，吴春丽,4*

(1.郑州大学药学院，河南郑州 450001；2.商丘爱己爱牧生物科技股份有限公司，河南虞城 476300；3.郑州爱己爱牧生物技术有限公司，河南郑州 450001；4.郑州市新型兽药制剂创新重点实验室，河南郑州 450001)

北芪五加颗粒由黄芪和刺五加，经水煎煮提取，减压浓缩成浸膏，加辅料混合均匀，制成颗粒，具有益气健脾功能[1-2]。本研究在前期急性毒性试验的基础上，参照《中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则》相关规定[3]，对其长期用药的安全性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 北芪五加颗粒，批号20110203(北芪五加颗粒浸膏和北芪五加颗粒原料)，规格1 g∶1 g生药，由商丘爱己爱牧生物科技股份有限公司提供。临用前用无菌水配成0.250、0.125、0.062 5 g/mL的液体。

1.1.2 实验动物 5周龄SD大鼠120只，SPF级，雌雄各半，购自河南省实验动物中心，许可证号为SCXK(豫)2010-0002。

1.1.3 主要仪器与试剂 ABX-PENTRA-80全自动血液细胞分析仪检测，法国Horiba ABX公司产品；BT-2000PLUS生化分析仪，意大利产Biotemcnica公司产品；XSP-24N型生物显微镜，南京江南光电集团股份有限公司生产；FA1004N电子天平，上海精密科学仪器公司天平仪器厂生产；YD-12P型全自动生物组织脱水机、 YD-6L型全自动生物组织冷冻包埋机、 YD-6D型全自动生物组织包埋机、 YD-B型智能型生物组织烤片机、 YD-A型智能型生物组织摊片机，浙江金华益迪医疗设备厂生产；LEICA RM2235型生物组织切片机，德国LEICA公司生产；XSP-24N型光学显微镜，南京江南光电集团股份有限公司生产；DM-BA300数码生物显微镜，厦门麦克奥迪公司生产。谷丙转氨酶(ALT)测试盒、谷草转氨酶(AST)测试盒、尿素氮(BUN)测试盒、血清(浆)尿肌酐(Cr)测试盒、总蛋白(TP)测试盒、白蛋白(ALB)测试盒、葡萄糖(GLU)测试盒和甘油三酯(TG)测试盒等，均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 选用临床健康大鼠80 只，随机分为4 个组，每组20只，雌雄各半，分笼饲养，每笼5只，用双染色法进行编号标记。由实验室前期对北芪五加颗粒原料急性毒性试验研究结果可知，以最大给药量(即67.5 g/kg 体重)给药后，小鼠未见任何异常与死亡。依据兽药研究技术指导原则汇编(2006年-2011年)中《兽药30 d和90 d喂养试验指导原则》[4]及不同种类动物间用药剂量换算公式[5-6]。猪，每kg饲料4.0 g，连用7 d，即等同于猪每天每kg体重颗粒用量0.32 g～0.4 g(相当于猪每天每kg体重用干浸膏0.04～0.05 g)。设计给药剂量，即北芪五加颗粒原料5、2.5、1.25 g/kg和空白对照组，给药各组分别以猪每日临床100、50、25倍剂量的北芪五加颗粒原料给大鼠灌胃，按20 mL/kg体重的用量，每天上午灌胃给药1次，空白对照组灌服同体积的无菌水。

1.2.2 观察指标[7-10]

1.2.2.1 一般观察 试验期间逐日观察并记录大鼠的精神状态、行为表现、采食情况、粪便。

1.2.2.2 体重影响 每周逐只称重1次，并根据体重变化调整灌胃量，连续给药28 d，观察至给药结束。

1.2.2.3 血液学及血液生化指标测定 给药第28天停药，各组末次给药 24 h后，称重、采血，用于生理和生化指标测定，血液学检查指标包括白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)、白细胞计数(WBC)及其分类[中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、单核细胞(MON)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)]；血液生化检查指标包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血清白蛋白(ALB)、血葡萄糖(GLU)和甘油三酯(TG)。

1.2.2.4 剖检情况 给药第28天，将采血后的20只大鼠处死，进行系统剖检，肉眼观察其组织器官，同时取其心、肝、肾、肺、脾睾丸、卵巢、子宫等脏器进行称重，计算脏器系数。脏器系数(%)= 脏器(mg)/体重(g)×100%

1.2.3 数据分析处理 采用SPSS11.0进行统计分析,One-way ANOVA法检验，组间用LSD法两两比较，P<0.05表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 一般观察

整个试验过程中，4组大鼠精神状态、行为表现、采食情况均正常，粪便呈棕黑色颗粒状。

2.2 体重变化情况

大鼠连续灌胃给药28 d后,各给药组雌雄动物的体重及增值与对照组动物比较，除雌性小鼠2.5 g/kg给药组给药第21天体重与对照组相比体重增加且差异显著(P<0.05)外，其余各组均未见显著性差异(表1)。

2.3 血常规指标变化

大鼠灌胃给药28 d后对所有实验动物进行血液学检测。其中，雌性动物2.5 g/kg给药组RBC数较对照组极显著升高(P<0.01)，雄性动物2.5 g/kg、5 g/kg给药组WBC较对照组极显著降低(P<0.01)，雄性动物2.5 g/kg给药组MONO较对照组显著升高(P<0.05)，其他指标均未出现统计学差异(表2)。

2.4 血液生化指标变化

大鼠灌胃给药28 d后对所有实验动物进行血液生化学检测。其中，雄性动物2.5 g/kg给药组、5 g/kg给药组TG较对照组极显著降低(P<0.01)。其他指标均未出现统计学差异(表3)。

表1 北芪五加颗粒对大鼠体重的影响

注：与空白对照组相比，“*”P<0.05 差异显著。

Note：Compared with blank control group,“*”significant difference(P<0.05).

表2 北芪五加颗粒对大鼠血常规的影响

注：与空白对照组相比，“*”P<0.05 差异显著，“* *”P<0.01 差异极显著。

Note：Compared with blank control group,“*”significant difference(P<0.05); “* *”very significant difference(P<0.01).

2.5 主要脏器系数测定结果

大鼠连续给药28 d后雄性动物2.5 g/kg、5 g/kg给药组肝脏的脏器系数较对照组极显著减小(P<0.01)，并呈浓度依赖性；而在雌性动物，只有5 g/kg给药组肝脏的脏器系数较对照组极显著减小(P<0.01)。其余各组均未见显著性差异(表4)。

2.6 组织病理学检查

HE染色后镜检观察，高剂量组大鼠的心、肝、脾、肺、肾与空白对照组相比，均未见与受试物毒性作用相关的组织病理学变化。

3 讨论

表3 北芪五加颗粒对大鼠血生化指标影响

注：与空白对照组相比，“* *”P<0.01 差异极显著。

Note：Compared with blank control group,“* *”very significant difference(P<0.01).

表4 北芪五加颗粒对大鼠主要脏器系数测定结果

注：与空白对照组相比，“* *”P<0.01 差异极显著。

Note：Compared with blank control group,“* *”very significant difference(P<0.01).

北芪五加颗粒原料以1.25、2.5、5 g/kg等3个剂量，连续给药28 d，试验观察期间，各组动物的精神状态、行为表现、采食、饮水、粪便均正常。其中，雌性大鼠2.5 g/kg给药组第21天体重与对照组相比有统计学差异，其余各组均无统计学差异。在血液学及血液生化学分析中显示雌性动物2.5 g/kg给药组RBC数较对照组有统计学差异，雄性动物2.5 g/kg、5 g/kg给药组WBC较对照组有统计学差异，雄性动物1.25 g/kg给药组MONO较对照组有统计学差异，雄性动物2.5 g/kg、5 g/kg给药组TG较对照组有统计学差异，这些指标改变均无剂量依赖趋势，也未超出本试验参考范围[11-13]，提示该项改变与供试品毒性无关。在脏器指数检测中，肝的脏器系数高剂量组较对照组有统计学差异[14]，但改变无剂量依赖关系，且病理学组织检查未见与药物毒性相关的病理改变，表明上述改变非药物毒性所致。卞愧等在五加芪粉长期毒性试验研究结果表明,五加芪粉以8.4 g/kg连续灌胃给药28 d未对大鼠产生毒副作用[15]，与本研究结果一致。

综上所述，SD大鼠灌胃给予北芪五加颗粒原料以1.25、2.5、5 g/kg等3个剂量，分别是临床拟用量的25、50、100倍，连续给药28 d并未对大鼠产生毒副作用。因此，北芪五加颗粒按照推荐的给药剂量和疗程使用，无长期毒性，临床应用安全。