膏霜类化妆品中瑞香科植物禁用成分的表面离子化-高分辨质谱快速识别技术研究

(1.威海出入境检验检疫局，威海 264200；2.北京出入境检验检疫局，北京 10026；3.中国检验认证集团检验有限公司，北京 10026)

2015年2月，中韩双方完成中韩自贸协定全部文本的草签，至此，我国迄今涉及国别贸易额最大、领域范围最全面的自贸协定完成全部谈判。中韩自贸区的建立和推进，加速了韩国化妆品对我国出口的力度。韩国化妆品虽然有着较好的质量和口碑，但由于法律法规的不同，中韩化妆品中有一些不同的禁用物质，比如说很多中药成分在中国是禁用的，但在韩国(其成为“韩药”)却是可添加的，比如瑞香科植物芫花、了哥王和狼毒。这些植物的禁用提取物为黄酮类化合物和双香豆素类衍生物，在化妆品中有防晒、抗氧化、美白和抑菌的作用[1]，但是在国内，因其本身的毒性被禁止添加到化妆品中。所以研究中韩化妆品中不同的禁限用物质，并建立快速检测方法，是保护我国消费者安全的必要技术基础。近年来，直接实时分析质谱(Direct Analysis in Real Time-Mass, DART-MS)超速分析方法是中药加工相关产业的研究热点之一。其无需溶剂辅助离子化，操作便捷，在特殊药物打假[2]、植物药成分分析[3]等方面均有应用。

本研究首次建立了DART-MS/MS快速检测霜状化妆品中植物提取物中禁用物质的方法，为进口产品快速通关起到了积极的作用。

1 仪器与试剂

DART SVP离子源(美国)； QExacfive高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；乙醇为分析纯(国药集团)；甲醇为色谱纯(美国thermo Fisher 公司)；芫花和了哥王购自河北安国，以《植物志》相关植株信息为依据，由尚孟军鉴定为芫花和了哥王，原植物为Daphne genkwa Sieb. et Zucc. 和Wikstroemia indica (Linn.) C. A. Mey

2 方法与结果

2.1 DART与质谱仪参数

DART离子源、传送管间距25mm，样品居中；离子源下倾角30°；电晕针电压4000V；氦气流速4L/min；气流温度350℃；出口电极偏转电压100V。串联高分辨质谱仪正离子模式；毛细管电压4000V；锥孔电压100V；碰撞能量33V。

2.2 植物提取物的制备

粉碎样品并将粉碎后样品过200目筛备用。称取过筛后样品5.0g于50mL离心管中，加入30mL70%乙醇振荡混匀，超声30min后，经6000rap离心10min，取上清液经0.2μm滤膜过滤后上机。

2.3 实测样品的制备

将植物粉碎后进行浸提，吸取20ml提取液于50mL离心管中，氮吹至近干，分别得芫花提取液浸膏13.0mg和了哥王提取液浸膏15.0mg备用。称取膏霜状化妆品5.0g，分别加入芫花提取物浸膏或了哥王提取物浸膏，分别混匀，备用。

3 结果与讨论

3.1 DART与质谱仪参数的优化

DART 检测为样品表面的待测物经离子源解吸并离子化后，在真空泵产生的负压作用下由传送接口引入质谱仪分析，原理详见文献[4]。本实验的待测物为黄酮类和香豆素类化合物，易结合质子，故设定为正离子模式。取对照品溶液5μL滴于条形载玻片上，挥干后置滑轨上进行DART 全扫描，质谱图中可见芫花素m/z285.0744[M+H]+、羟基芫花素m/z301.0693[M + H]+、西瑞香素m/z353.0639[M + H]+和芫花素m/z285.0761[M + H]+，比较不同条件下信号的强弱，选择信号强且稳定时的参数。试验发现，氦气( He) 的灵敏度明显高于氮气( N2)，故选择He；He流速固定为4 L·min- 1; 比较气流温度时发现待测物在100℃和200 ℃时几乎没有信号， 300 ℃时信号较高，至350 ℃时信号达到最高，升到400 ℃又有下降，故选350 ℃; 离子源与传送管距离为25 mm，兼顾信号强度和滑轨的运行。

3.2 植物提取物禁用成分DART-MS( FULL SCAN) 分析

按照2.2项的条件采集植物提取溶液的特征谱图，见图1和图2。

图1 芫花提取物的DART-MS质谱图

图2 了哥王提取物的DART-MS质谱图

DART属于复合型电离, 在正离子工作模式下首先由激发态氦气与空气中的水分子发生潘宁电离产生水合物离子与电子, 质子化的水分子离子再与目标化合物进行质子交换, 可以形成[ M +H]+分子离子峰。本实验质谱条件为正离子检测，一级质谱扫描为全扫描，质量数范围为100～1000m/z。一级质谱全扫描等相关条件见表1。

表1 植物提取物中特征性目标化合物中、英文名称，分子式，分子量

故芫花提取物中的芫花素和羟基芫花素，其m/z分别为285.0744和301.0693；了哥王植物提取物中的西瑞香素和芫花素，其m/z分别为353.0639和285.0761。其相对应的分子离子峰结果可见图3～图6。由此可见，DART-MS 特征图谱具有明显的指纹性特征，借助DART能够进行快速、直观地鉴别相关的植物。

图3 芫花提取物中芫花素的一级质谱图

图4 芫花提取物中羟基芫花素的一级质谱图

图5 了哥王提取物中西瑞香素的一级质谱

图6 了哥王提取物中芫花素的一级质谱

3.3 植物提取物禁用成分质谱峰的确认

由于一级质谱可能存在假阳性，需进行二级质谱确证。本实验质谱条件为正离子检测，扫描范围100～850m/z，二级质谱全扫描等相关条件见表2。

表2 目标化合物二级质谱测定参数

芫花素和了哥王植物提取物中目标化合物的CID质谱图和裂解示意，见图7～图10。其中，芫花素在正离子测定模式下准分子离子峰m/z285.21进行二级质谱分析，该离子丢失一个甲基生成m/z270.0526离子，碎片m/z242.0576 ；羟基芫花素在正离子模式下准分子离子峰m/z301.07进行二级质谱分析，该离子丢失一个甲基生成m/z286.0475离子，碎片m/z258.0528为m/z286.0475峰脱去一个-(CH2)2形成的；西瑞香素在正离子测定模式下准分子离子峰m/z353.07，该离子脱去一个甲基形成m/z338.0425，再通过联苯醚的碳氧键断裂，形成m/z179.0342的离子。

图7 芫花提取物中芫花素m/z285.1二级质谱图

图8 芫花提取物中羟基芫花素m/z301.1二级质谱图

图9 了哥王提取物中西瑞香素m/z353.1二级质谱图

图10 了哥王提取物中芫花素m/z285.1二级质谱图

3.4 实测样品中植物提取物禁用成分DART-MS( SCAN) 分析

按照2.3的条件分别制作芫花和了哥王植物提取物实测样品，混匀后直接按照3.2的扫描条件进行DART-MS(SCAN)分析。结果如图11～图16所示。

图11 膏霜状化妆品中芫花植物禁用成分DART-MS(FULL SCAN)质谱图

图12 膏霜状化妆品中了哥王植物禁用成分DART-MS(FULL SCAN)质谱图

图13 实测样品中芫花所含芫花素的一级质谱图

图14 实测样品中芫花所含羟基芫花素的一级质谱图

图15 实测样品中了哥王所含西瑞香素的一级质谱图

图16 实测样品中了哥王所含芫花素的一级质谱图

从图11～图16可见，DART-MS在正离子模式下对实测样品进行了全扫描，结果显示，可以从膏霜状化妆品中分别检测出芫花中的芫花素、羟基芫花素，以及了哥王中的芫花素和西瑞香素。

4 结论

采用DART-MS建立的检测方法无需前处理和色谱分离，无需制备流动相，减少了试剂的耗费，交叉污染很小，单个样品分析( 测定3次) 约20 s，检测速度快。SCAN 模式的DART-MS 特征图谱包含丰富的定性信息，能对植物源性化妆品等复杂基质进行鉴别，可以找出化妆品中相关的植物禁用物，同时该图谱具有较好的重复性，可借助化学计量学方法对数据进一步处理。能够很好的解决韩国进口化妆品中国内禁用植物成分的快速筛查，提高通关速度。该法为定性方法，在定量的准确度方面较常规色谱法或色谱-质谱联用法尚有不足，因其具有原位、直接、快速检测的优势并兼有强大的定性能力，在快速真伪定性鉴别、高通量筛查或快速定量分析时具有优势和应用前景。