甘草内生细菌对4种植物病原菌的抑菌谱及其16S rRNA系统发育分析

祖丽皮亚木·木沙尔,李 丽,郭建伟,3,古丽斯玛依·艾拜都拉,OSAMA Mohamed,4

(1.新疆大学 生命科学与技术学院 新疆资源微生物实验室，乌鲁木齐 830046；2.中国科学院 新疆生态与地理研究所 干旱区生物地理与生物资源重点实验室，乌鲁木齐 830011；3.红河学院 云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自 661100；4.Environmental Science Department,Institute for Postgraduate Environmental Studies,Suez Canal University,El-Arish Branch,North Sinai 45511,Egypt)

植物内生细菌主要存在于植物细胞内或细胞间隙，不易受环境的干扰，因此与其他生物防治因子相比，具有较大的优势；对寄主植物具有抗病虫害、促生、内生固氮、杀线虫等多种作用[1]。2007年，龚明福等[2]从乌拉尔甘草获得125株内生细菌，以对峙培养法筛选出31株对棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)具有较强拮抗活性的菌株；饶小莉等[3]从乌拉尔甘草中分离到98株内生菌，并采用平板对峙法筛选出6株对棉花枯萎病菌(F.oxysporum)等8株植物病原菌具有拮抗活性的菌株。此外，程晓燕等[4]以免培养法对150个克隆测序发现32个分类单元，其中归属于变形菌门(Proteobacteria)的alpha、gamma亚群、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)中的鞘脂菌属(Sphingobium)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、生丝单胞菌属(Hyphomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)等14个属，其中，26%的克隆与已知细菌16S rDNA基因相似性小于96%，代表潜在的新分类单元。由此可见，甘草中具有丰富的内生细菌资源，并且其内生细菌中存在丰富的植物病原真菌拮抗菌株资源。本研究拟从100株甘草内生细菌中筛选出对石榴枯萎病甘薯长喙壳等4种植物病原真菌有抑制作用的菌株，以期为甘草内生细菌的应用开发提供潜在生防菌资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试病原菌：石榴枯萎病菌甘薯长喙壳YP-1(CeratocystisfimbriataEllis and Halsted,缩写为Cf YP-1)、草果假茎黑斑病小孢拟盘多毛孢菌CGJ-1(Pestalotiopsismicrospore,缩写为Pm CGJ-1)、 草果叶斑病镰刀菌 Ayb-3(Fusariumsp,缩写为F Ayb-3)、 墨兰炭疽病胶胞炭疽菌 ML-2(ColletotrichumgloeosporioidesAllesch,缩写为Cog ML-2)共4种植物病原菌，均由云南红河学院云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室提供。

供试甘草内生细菌：100株甘草内生细菌由中国科学院新疆生态与地理研究所特殊环境微生物实验室提供。

1.1.2 培养基 酵母-麦芽膏培养基(ISP 2)：酵母膏 4.0 g， 葡萄糖 4.0 g， 麦芽膏 5.0 g，微量盐溶液 1 mL，琼脂 15.0 g，水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

马铃薯培养基(PDA)：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 17 g，水 1 000 mL，pH 自然。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌、甘草内生细菌的活化 将4种病原真菌分别接在PDA和ISP 2平板上，28 ℃恒温培养3 d，待菌丝长满平板后转4 ℃冰箱保存，备用。将纯化的甘草内生细菌接种于ISP 2平板，30 ℃ 恒温培养。

1.2.2 拮抗菌株的筛选 供试细菌拮抗作用的初步筛选采用平板对峙培养法。以Cf YP-1作为供试病原菌，接种于ISP 2平板中央，用接种环挑取内生细菌点接在距平板中央3 cm处的4个角点上，以仅接病原真菌的平板作为对照，每处理设3次重复。28 ℃恒温培养7 d，观察内生细菌对病原真菌的拮抗作用，测定病原菌菌落扩展半径并计算其相对抑菌率。

I= (R0-Ri)/R0×100%。

式中：I代表相对抑菌率，R0代表对照组病原菌菌落的扩展半径，Ri代表试验组病原菌菌落的扩展半径。

根据初步筛选试验结果筛选出相对抑菌率大于10%的菌株，对其采用平板对峙培养法在 PDA 平板上再次筛选，每处理设3次重复。

1.2.3 拮抗菌株抑菌谱的测定 以Pm CGJ-1、F Ayb-3、Cog ML-2为供试病原菌，采用平板对峙培养法，以不接种目的细菌作为对照，于28 ℃下恒温培养5～7 d后测定病原菌菌落的扩展半径并计算其相对抑菌率。

1.2.4 拮抗菌株的鉴定 采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)测定菌株的16S rRNA基因序列。反应体系(50 μL)：10 × EasyTaqBuffer(Mg2+2 mmol·L-1) 5.0 μL、dNTPs(2.5 mmol·L-1)4.0 μL、引物27F (10 pmol·L-1) 1 μL，引物1492R (10 pmol·L-1) 1 μL、EasyTaqDNA酶(5 U·μL-1) 0.5 μL，Template DNA 2 μL、用ddH2O补足至50 μL。PCR反应程序：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 2 min(30个循环)；延伸72 ℃ 10 min。根据测序结果，在Ezbiocloud ( EzTaxone server)和BLAST对其进行在线序列比对并确定菌株的系统发育地位，最后利用MEGA 6.0软件构件系统发育树。序列测定委托生工生物工程股份有限公司完成。

1.2.5 数据处理 采用单因素方差分析比较不同菌株病原菌拮抗活性之间的差别，从而检验不同菌株拮抗活性之间的差别是否有统计学意义，病原菌菌落扩展半径为3次重复试验的平均值，统计分析利用SPSS 16. 0软件进行。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的筛选

测定100株甘草内生细菌对石榴枯萎病菌甘薯长喙壳的拮抗能力，为排除一些人为误差，以相对抑菌率超过10%认为有抑菌作用，结果表明有61株菌对石榴枯萎病菌有抑制作用。 从甘草内生细菌对石榴枯萎病菌的拮抗能力测定结果可知(表1) ，61株拮抗菌中，拮抗能力强的菌株有13个，占拮抗菌株总数的21%，菌株号分别为G010、G012、G033、G038、G039、G046、G050、G057、G072、G092、G101、G124和G127，抑菌半径均超过15 mm。拮抗能力中等的和能力弱的菌株分别有36株和12株，分别占拮抗菌株总数的59%和20%。

2.2 13株强拮抗性菌株抑菌谱的测定

13株强拮抗性甘草内生细菌对不同病原菌的抑菌作用测试结果表明，它们不仅对石榴枯萎病菌YP-1有抑制作用，而且对草果假茎黑斑病菌CGJ-1、墨兰胶胞炭疽菌ML-2及草果叶斑病菌Ayb-3都有一定的抑制作用，表现出抑菌广谱性，这些病原菌包括半知菌类的拟盘多毛孢属、炭疽菌属和镰刀菌属。

从13株菌对石榴枯萎病菌YP-1的抑菌半径来看，菌株G127与其他菌株之间有显著性差异，其抑菌半径达(18.54±0.48) mm；然而其余菌株彼此之间均无显著差异，抑菌半径为(13.68±0.89)～(15.45±0.75)mm(表2)。

表1 61株拮抗性菌株对石榴枯萎病菌的抑菌作用Table 1 Inhibition activities of 61 endophytic bacterias isolated from Glycyrrhiza against pomegranate wilt pathogen

注：Yp-1表示石榴枯萎病甘薯长喙壳。抑菌半径为5.00～10.00 mm：“+”即弱；10.00～15.00 mm：“++”即中；15 mm以上：“+++”即强 。

Note: Yp-1 indicatesCeratocystisfimbriataEllis and Halsted. In inhibition zone width of 5.00-10.00 mm,“+”means weak ,in width of 10.00-15.00 mm,“++”means medium，width of >15 mm,“+++” means strong.

菌株G057、G124、G127对草果假茎黑斑病菌CGJ-1 的抑制能力相比其他菌株较高，而彼此之间差异不显著，其抑菌半径达(20.38±1.24)～(21.27±0.86)mm；菌株G012 与G039与其他菌株间的抑菌能力差异显著，其抑菌半径分别为(15.88±0.39) mm、(17.15±1.06) mm。

13株菌对墨兰炭疽菌ML-2的抑菌作用中，G038、G050、G092等3株菌对此病原菌无抑制作用；菌株G057与其他菌株间差异显著，抑制能力较强，抑菌半径达(20.70±0.21) mm；菌株G033、G039、G046、G101、G127的抑菌半径达(17.97±1.11)～(18.95±0.93)mm，彼此之间差异不显著，但与其他8株菌(抑菌半径均等于或小于16.46 mm±0.53 mm)的抑菌能力差异显著(表2)。

13株菌对草果叶斑病镰刀菌 Ayb-3 的抑菌作用中，菌株G057与其他菌株间差异显著，抑菌半径达(25.17±1.03) mm；菌株G010、G012、G033、G038、G050、G092、G101、G124、G127的抑菌能力相当(P>0.05)，抑菌半径在(20.16±0.38)～(22.31±0.44)mm；菌株G046的抑菌半径为(22.98±0.74) mm，与G092、G101、G124差异显著(表2)。

表2 13株强拮抗性菌株抑菌谱的测定Table 2 Determination of antifungal spectrum of 13 strong antagonistic strains

注：表中值为“平均值±标准偏差”。同列数字后面小写字母不相同表示处理间在0.05水平上差异显著，同行数字后面的大写字母不相同表示处理间在0.05水平上差异显著(P<0.05)。YP-1表示石榴枯萎病菌甘薯长喙壳，CGJ-1表示草果茎斑病小孢拟盘多毛孢菌，Ayb-3表示草果叶斑病镰刀菌，ML-2表示墨兰胶胞炭疽菌。

Note:Data are “means± SE”.The lowercase letters in the same columns mean significant difference at 0.05 level,different uppercase letters in the same rows mean significant difference at 0.05 level (P<0.05).YP-1 representsCeratocystisfimbriataEllis and Halsted,CGJ-1 representsPestalotiopsismicrospore,Ayb-3 representsFusariumsp ML-2 representsColletotrichumgloeosporioidesAllesch f.cymbidiiAllesch.

13 株菌株对同一种病原菌的抑制能力不同之外，同种甘草内生细菌对不同病原菌的抑制能力也不同。菌株G012、G033、G039、G046、G057、G101对石榴枯萎病菌YP-1、草果茎斑病菌CGJ-1和墨兰炭疽菌ML-2的抑菌半径差异显著，而对草果茎斑病菌CGJ-1和草果叶斑病镰刀菌 Ayb-3的抑菌半径差异不显著；菌株G072、G124、G127对石榴枯萎病菌YP-1和草果茎斑病菌CGJ-1的抑菌半径差异显著，而对石榴枯萎病菌YP-1和墨兰炭疽菌ML-2的抑菌半径差异不显著；同理，菌株G092对石榴枯萎病菌YP-1、草果茎斑病菌CGJ-1的抑菌半径差异显著，而对草果茎斑病菌CGJ-1和草果叶斑病镰刀菌Ayb-3的抑菌半径差异不显著；菌株G010对石榴枯萎病菌YP-1、草果茎斑病菌CGJ-1、草果叶斑病镰刀菌Ayb-3的抑菌半径差异显著，而对石榴枯萎病菌YP-1和墨兰炭疽菌ML-2的抑菌半径差异不显著(表2)。

2.3 13株强拮抗性菌株的鉴定

16S rRNA基因序列测定结果表明(表3)，这13株菌分别属于2个属的3个种。其中，菌株G012为微杆菌属的副氧化微杆菌(Microbacteriumparaoxydans)(图1)，而菌株G046为芽孢杆菌属的莫哈韦芽胞杆菌(B.mojavensis)(图2)，序列相似性分别为99.78%和99.85%。菌株G010、G033、G038、G039、G050、G057、G072、G092、G101、G124、G127被鉴定为芽孢杆菌属的萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)，序列相似性为99.93%(图2)。

3 讨论与结论

平板对峙法筛选拮抗菌操作简便，直观，成本低，是一种体外有效筛选拮抗菌的方法。Pilar等[5]发现荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)PICF7不但能在橄榄树中定殖还能在根茎叶中迁移，定殖后对橄榄黄萎病表现出很强的抗菌活性；刘霞等[6]从陕北野生甘草内生菌中分离到的12株内生细菌发酵液对7种植物病原真菌菌丝均有不同程度的抑制作用，其中菌株号为X6的菌株对番茄灰霉病菌的抑制率高达90.67%。上述结果表明筛选植物病原菌拮抗性内生菌时可以从不同种植物中进行。本研究从100株甘草内生细菌中筛选出对石榴枯萎病有高拮抗活性的菌株13个，这与刘建利等[7]从宁夏乌拉尔甘草不同组织部位分离的151株内生细菌具有8株对4种甜瓜采后病害病原菌均具有较高抑菌能力菌株的研究结果类似，这些研究成果说明甘草内生细菌是许多未知植物病原菌的拮抗菌种库。

表3 13株强拮抗性菌株的鉴定结果Table 3 Identification results of 13 strong antagonistic strains

图1 强拮抗性菌株G012系统发育树的构建Fig.1 Construction of phylogenetic tree of strong antagonistic strain G012

王美琴等[8]对分离自番茄的374株菌进行抑菌测定试验，发现有20株菌对番茄灰霉病菌和叶霉病菌都具有抗菌活性，并且多数菌株对灰霉病菌有强拮抗作用而只有1株菌对叶霉病菌有强拮抗作用。本研究中筛选到的13株菌对不同病原菌的抗菌作用也有差异，如菌株G038对4种病原菌拮抗作用之间均有差异(表 2)，而菌株G127对石榴枯萎病菌YP-1和墨兰炭疽菌ML-2的抑制能力差异不显著，这表明同一株菌对不同病原菌的抗菌作用也可能不同。

图2 12株强拮抗性菌株系统发育树的构建Fig.2 Construction of phylogenetic tree of 12 strong antagonistic strains

芽孢杆菌属(Bacillus)是组成植物微生态体系的优势种，由于具有抗菌谱广、抗逆性强等特点而被看作为理想的生防细菌来源之一，因而较多的应用于农作物病害的生物防治中。崔郑龙等[9]对分离自乌拉尔甘草的11株内生细菌进行棉花枯萎病拮抗菌株的筛选试验，结果发现有2株菌对该病害表现出强拮抗活性，并对其进行16S rDNA 测序得知该菌株分别为解淀粉枯草芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)。本研究得到的13株强拮抗性菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)和微杆菌属(Microbacterium)，其中12株菌为芽孢杆菌属(Bacillus)，该结果与前人研究是类似的，进一步表明芽孢杆菌属是重要的植物病原菌拮抗菌类群。

在筛选拮抗菌时，供试细菌与供试病原真菌之间均产生较为明显的抑菌圈，这说明可能是在细菌的代谢过程中产生具有抑菌活性的物质，并进一步抑制病原真菌菌丝生长。但是拮抗细菌的抑菌机制比较复杂，而且拮抗细菌的田间生防效果还受到拮抗细菌寄主上的定殖率、土壤微生物等[10-11]因素影响，因此本试验中拮抗性菌株抑菌机制及定殖率的研究是进一步挖掘其生防潜力的新目标。

植物内生菌存在于植物细胞或细胞内相对稳定的环境系统中，相比根际菌株所受的外界干扰较少；植物内生细菌繁殖快，易于培养，在植物体内占据一定的生态位，并能与病原菌竞争生存空间而发挥生防作用[1]，这些特点决定植物内生细菌在工农业发展中的潜在应用价值。农药及化肥引起的一系列环境问题的出现，生防菌株的发现以及内生菌控制植物病害途径的多样化加快生态型农业的发展，利用这些生防菌开发微生物菌剂、微生物菌肥，替代或减少农药、化肥的使用，提高农作物产量的同时有利于保护濒危药用植物资源，还可保持和丰富植物微生态系统的物种多样性。