高温胁迫对小麦花药叶绿素质量分数及RuBP羧化酶基因表达的影响

侯泽豪，张迎新,2，王 欢，孙坤坤，方正武，马东方，张改生，王书平

(1.长江大学 农学院/湖北省涝渍灾害与湿地农业重点实验室，湖北荆州 434025；2.中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京 100101；3. 西北农林科技大学 农学院/小麦育种教育部工程研究中心，陕西杨凌 712100)

高温胁迫是指植物体由于周围生长环境温度过高而引起的植物生理性伤害。近年来，随着大气中CO2和其他温室气体排放量的逐年升高，地球表面平均温度也在日益增高，高温胁迫给全球农业生产带来了极大危害[1-2]。有关温度变化对全球谷物供应的研究表明，大气温度的升高将会导致全球谷物大幅度减产[3-4]。因此，有关高温胁迫对植物生长发育的影响也备受关注[2,5-6]。

叶绿体是进行光合作用的重要场所，而叶绿素是叶绿体的主要成分，也是植物进行光合作用的主要色素，其质量分数的多少更是衡量植物光合效率的重要生理指标之一，因此，对叶绿素的提取及质量分数的测定一直是植物生化研究的重要内容。研究已经表明，叶绿素对温度的变化最为敏感，其质量分数的多少则直接影响光合效率的强弱[7-9]。而高温胁迫对不同植物叶绿素的影响也不尽相同，花生幼苗在高温42 ℃处理过程中，叶绿素质量分数随着处理时间的延长而下降，具体表现为初期下降幅度平缓，后期变化明显[10]。而银杏在45 ℃高温胁迫下叶绿素质量分数则增加[11]。高温胁迫下春小麦旗叶叶绿素质量分数从灌浆期到成熟期明显降低[12]；因此，研究和揭示高温胁迫下小麦花药叶绿素质量分数的变化规律，将更有助于降低高温对小麦叶绿素的破坏，确保小麦的高产和稳产。

1,5-二核酸核酮糖羧化酶(RuBPcase)目前被认为是对温度最敏感的光合酶，并且是决定C3植物光合碳代谢方向和效率的关键酶。研究表明，RuBPcase是高温抑制卡尔文循环的主要发生位点。Nakano等[13]研究发现，温度胁迫可能导致光合作用暗反应中CO2同化的关键酶RuBPcase的活性受到影响。黄瓜幼苗在高温(42 ℃/32 ℃)胁迫下的RuBP羧化酶(RuBPCase)和Rubisco活化酶(RCA)活性及其mRNA表达量逐渐降低，而在亚高温(35 ℃/25 ℃)下的胁迫初期变化不大，后期开始趋于降低[14]。玉米的成熟叶片和幼嫩叶片在高温胁迫下RuBP羧化酶的活性则显著降低[15]。而薛伟等[16]的研究发现，高温胁迫使作物叶片RuBPcase的活性先增加后降低，最终造成光合性能下降，导致叶片衰老加速。而鲜见有关高温胁迫下小麦花药叶绿素质量分数、RuBP羧化酶活性及其基因表达的研究。

小麦的花药壁中也存在大量的叶绿体，这些叶绿体能够进行光合作用，其产物是花药绒毡层、胼胝质生长和花粉粒发育的重要物质和能量来源之一[17]，一旦该生理过程发生紊乱，必然会导致雄性不育，进而造成花药败育甚至绝收。本研究以小麦不同发育时期的花药为材料，比较分析高温胁迫对小麦花药叶绿素质量分数、RuBP羧化酶活性及其基因表达的影响，旨在揭示高温胁迫下小麦花药败育过程中叶绿素质量分数的变化规律及光合碳代谢关键酶的响应过程，探索小麦高温胁迫响应机制，对提高小麦的耐热性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料处理

供试小麦品种为‘西农1376’。待花药发育至单核早期，于人工气候室中进行高温胁迫处理，设置温度分别为(42±1) ℃(高温胁迫处理) 和(25±1) ℃(对照),湿度为(70±5)%，每天处理3 h，共3 d，此时花药已发育至单核后期。4 ℃分别收集单核后期、二核期、三核期的花药，取样时期的确定按Wang等[18-19]的方法进行。

1.2 穗部形态学观察

采用数码相机获取小麦穗部图像，新鲜收集的成熟花粉粒采用w=2% I2-KI染色，在显微镜下观察并拍照。

1.3 叶绿素提取

叶绿素的提取参照李得孝等[20]的方法并略加修改，取0.25 g小麦花药，立即置于浸提液[V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1]中，在25 ℃恒温摇床(110 r/min，避光)下浸提18 h，经过滤、洗涤后定容至25 mL，并立即在645 nm和663 nm波长下测定其吸光值。所得数据经Amon法修正公式计算叶绿素质量分数[21]：

叶绿素a(mg/g)=(12.71×A663-2.59×A645)×V/W

叶绿素b(mg/g)=(22.88×A645-4.67×A663)×V/W

叶绿素总质量分数(mg/g)=(8.04×A663+20.29×A645)×V/W

式中：A663、A645分别为663 nm、645nm 波长下的吸光度，V为提取液的体积，W为花药的鲜质量。

1.4 RuBP羧化酶提取及活性测定

RuBP 羧化酶的提取按苌建峰等[22]的方法进行，并略加修改。取小麦花药0. 25 g(鲜质量) 置于预冷的研钵中，加入2 mL 预冷的100 mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液[φ=10%甘油、w=1% PVP、1 mmol/L EDTA、7 mmol/L 巯基乙醇，pH 7.8]，冰浴中研磨，匀浆后于4 ℃下15 000 g 离心20 min,取上清液待测。RuBP 羧化酶酶活性参照魏爱丽等[23]的分光光度法进行测定。

1.5 荧光定量PCR分析

按照Trizol Reagent Kit(Invitrogen公司)的操作说明，提取总RNA。经12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量后，依照反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa公司)的操作说明进行cDNA合成。荧光定量PCR采用SYBR Premix ExTaq试剂盒(TaKaRa公司)在CFX96RealTime PCR System上进行，按照试剂盒的说明进行操作。使用Actin基因作为内参基因，并利用2-△△Ct法计算相对表达量，所检测基因和特异引物序列见表1。

1.6 统计分析

试验设置3个生物学重复，每个重复进行3次测量。采用Microsoft Excel 2010进行数据整理，采用Origin 9.0软件进行差异显著性分析及绘制图表。

表1 相关基因荧光定量PCR引物Table 1 Specific primers in this study

2 结果与分析

2.1 高温胁迫诱导小麦产生雄性不育

对高温胁迫后的植株观察发现，散粉后，可育穗因自花授粉颖壳表现为闭合(图1-A)，成熟花粉粒含有丰富的淀粉粒而被I2-KI溶液染成深蓝色(图1-C)。相反，高温胁迫后的花药细胞质稀薄，其花粉粒败育比较彻底没有淀粉积累(图1-D)，且在没有接授外源花粉的情况下，不育穗的颖壳保持张开状态(图1-B)。经统计分析其雄性不育率均在98%～100%，饱和授粉结实率均在98%以上，表明高温胁迫对子房的发育基本没有影响，而对花药是否可育起着决定性的作用。

A.对照组 Control；B.高温处理组 High-temperature stress；C、D.成熟花粉粒I2-KI染色比较观察 Comparison of matured pollen grain by I2-KI staining

图1小麦形态学比较观察
Fig.1Comparisonofmorphologicalfeaturesofwheatplants

2.2 高温胁迫对小麦花药叶绿素质量分数的影响

由图2可知，高温处理及对照的花药叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素质量分数均随发育时期呈持续下降的趋势。正常发育的小麦花药经高温胁迫后，其叶绿素a质量分数在单核后期、二核期和三核期分别显著降低8.58%、23.87%和33.68%。与叶绿素a相比，叶绿素b对高温胁迫更为敏感，在相应发育时期的降幅较大，分别比对照降低20.07%(单核后期)、39.81%(二核期)和44.91%(三核期)。这使得高温胁迫下花药总叶绿素质量分数较对照显著降低12.55%(单核后期)、29.89%(二核期)和39.11%(三核期)。

2.3 高温胁迫对花药中RuBP羧化酶活性影响

RuBP羧化酶是光合作用中羧化阶段的关键酶，其活力的高低直接决定着光合碳同化的速率。因此，对不同发育时期的小麦花药的RuBP羧化酶活性进行分析(图3)。结果显示，RuBP羧化酶的活性与花药的发育时期呈负相关，即随花药发育进程的推进而逐渐降低。与对照相比，高温胁迫从单核后期开始显著减低花药中RuBP羧化酶的活性，为对照的73.53%。且随着后期的发育而不断加剧，二核期时是对照的65.62%。而在花药发育至三核期时差异达到最大，仅是对照的52.05%。

“*”表示处理间的差异显著，下同

“*”mean significant among treatments，the same below

图2高温胁迫对不同发育时期的花药
叶绿素质量分数的比较分析
Fig.2Comparativeanalysisofchlorophyllmassfractionofantheratdifferentdevelopmentperiodsunderhightemperaturestress

图3 高温胁迫对不同发育时期花药的RuBP羧化酶活性的比较分析Fig.3 Comparative analysis of activity of RuBPcase of anther at different development periods under high temperature stress

2.4 高温胁迫对花药中RuBP基因表达模式的分析

进一步采用荧光定量PCR技术检测RuBP羧化酶的表达水平，结果表明，在整个花药发育过程中，RuBP羧化酶的表达水平与其活性的变化趋势保持一致，也随发育时期的推进而下降，且高温胁迫显著减低RuBP羧化酶的表达水平(图4)，分别比对照降低16.56%(单核后期)、35.48%(二核期)和56.56%(三核期)。

3 讨 论

小麦在生殖生长阶段，孢原细胞经过平周分裂形成初生壁细胞和造孢细胞，造孢细胞进一步发育为小孢子母细胞，小孢子母细胞再经2次减数分裂和2次有丝分裂形成有3个细胞构成的成熟花粉粒[18,24]。因此，成熟花粉粒的形成过程需要严格遵循细胞分裂周期的发育程序，一旦该程序被干扰，则会出现花粉败育[18,25]。当外界环境温度达到一定的阈值时，将有可能引起小麦花药分裂周期的紊乱而产生败育。本研究中，正常生长发育的小麦花药，经高温胁迫后，小孢子发生彻底的败育，且败育效果稳定，但子房仍能维持较高结实能力。这为非生物胁迫下小麦生殖生长、花粉发育的研究提供了理想的材料，也为研究作物耐热性的分子遗传基础及提高作物的抗热性提供了捷径。s

图4 小麦花药中RuBPcase基因表达水平分析Fig.4 Comparative analysis of relative expression of RuBPcase gene of anther

叶绿素是植物体内叶绿体的重要组成成分，是植物光合作用中吸收光的主要色素，能将捕捉到的光能转化为生物能，为植物生长发育提供所需的营养物质和能量。处于生殖发育时期的花药，则需要更多的物质和能量来确保小孢子母细胞顺利形成成熟花粉粒，而花药壁中的叶绿体是这些物质和能量来源的重要器官之一[17]，因此叶绿素与雄性不育有着密切的关系。李冰等[26]以赤茄和栽培品种远缘杂交选育得到的核质互作型雄性不育系‘052506’和其保持系‘052507’为材料，测定分析叶片叶绿素的质量分数，结果显示不育系叶绿素质量分数幼苗期低于保持系，盛花期和保持系相近，结实期高于保持系。高国训等[27]的研究结果认为在芹菜不育系的花器官中，叶绿素a和叶绿素b均低于其保持系。本研究中，在高温胁迫的初期已经对花药的叶绿素合成系统产生影响，且与花药的发育呈正相关，胁迫初期叶绿素a质量分数下降幅度小于叶绿素b，主要原因是叶绿素b对温度更为敏感[28]。

在高等植物中，具有不同光合碳循环途径的植物其碳同化受高温的影响也各异，其中，CAM(景天酸代谢)植物对高温最不敏感，C4植物对高温有较高的抗性，而C3植物则对高温极为敏感[29]。RuBP羧化酶/加氧酶是处于光合碳还原和光合碳氧化两个方向相反但又相互连锁的循环交叉点上，它对净光合速率起着决定性的作用，也是光合碳同化的关键酶，一直以来是众多学者研究的焦点[13]。本研究中，高温胁迫导致了光合作用暗反应中的RuBP羧化/加氧酶的羧化效率受到影响，胁迫后花药各个时期的RuBP羧化酶活性及表达水平均显著降低(图3和图4)。过高的温度会导致光合作用暗反应中的RuBP羧化/加氧酶的羧化效率下降进而导致净光合速率下降，而下降到一定程度时，植物将失去自养能力[30]。这对于生殖器官花药来说，则表现为败育。