目前对猪肺炎支原体诊断和流行病学的观点

Sibila M Pieters M Molitor T Maes D Haesebrouck F Segales J

陈善真1 曹仁祺2 饶 雷2 张居荣2 陈海辉2 林显站2 王贵平*译

（1广东海大畜牧兽医研究院，广东广州 511400；2阳西县丰沃生态农业有限公司，广东阳江 529800）

猪支原体是猪地方性肺炎的主要病原，其他病原如巴氏杆菌、猪传染性胸膜肺炎杆菌、猪鼻支原体、链球菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血性波氏杆菌、化脓隐秘杆菌也经常继发感染。该病的特征是高发病率和低死亡率，尽管各年龄段的猪群均易感，但地方性肺炎在小于6周龄的仔猪群中并不常见。肥育中期到屠宰期间的青年猪地方性肺炎的流行率特别高，而临床症状的严重程度取决于猪支原体毒株、感染压力、是否存在继发感染和环境因素。当肺炎支原体感染未伴有其他病原继发感染时，地方性肺炎表现为亚临床经过，伴随轻微的临床症状包括慢性干咳、平均日增重减少和饲料转化率降低；当伴随继发感染时，临床症状包括呼吸困难、发热，偶尔出现死亡。

猪支原体密切参与了猪呼吸道综合征的发病，该病是既有细菌（可能潜在参与了地方性肺炎的细菌）又有病毒（猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪2型圆环病毒、伪狂犬病毒、猪流感病毒和猪呼吸道冠状病毒）参与的疾病。猪呼吸道综合征通常影响14～20周龄的育肥猪，临床主要表现为生长速度和饲料转化率下降，同时伴有食欲减退、发烧、咳嗽和呼吸困难。该病在此阶段猪群高度流行，所以也被称为“18周龄墙”。

尽管通过改进管理措施、合理地使用药物和疫苗，很大程度上减轻了地方性肺炎对猪群健康和胴体品质的不利影响，地方性肺炎对全世界养猪业造成的经济损失仍然不容忽视。这些损失主要归因于日增重降低、料肉比增高、药物治疗费用增加，在一些案例中，死亡率也在增加。

充分了解猪肺炎支原体及其他相关病原的传播途径，对于控制该病、理解该病发病机制的影响因素是必要的。总结了在目前不同生产系统下猪支原体传播和血清转换动力学的知识，比较了监测地方性肺炎的不同流行病学工具，同时讨论了猪支原体肺炎毒株的不同毒力特征和目前检测应用的分子生物学技术。

1 评估猪支原体感染的流行病学和诊断学工具

调查和控制传染性疾病取决于诊断方法的可利用性。下面介绍几种监测猪支原体感染常用的诊断方法。

1.1 临床症状

地方性肺炎的主要临床表现是逐渐出现慢性干咳，尤其是在生产周期的育肥猪阶段。和如前所述的其他病原共感染后导致发热、厌食和呼吸困难。虽然是逐渐出现的，但咳嗽反复发作，程度也因猪支原体的感染剂量不同有所差别。为了确认猪是否干咳，对于猪群的观察需要足够的时间跨度，而且最好是赶猪运动。在给定时间段内确定咳嗽猪的头数（“咳嗽评分系统”）已经被用于猪肺炎支原体传播和致病机制的研究，也被用于评估猪支原体疫苗对自然感染和实验条件下感染猪的免疫效果。然而，考虑到缺乏咳嗽的诊断特异性而且亚临床感染的猪不会表现咳嗽症状，还需要配合使用其他诊断方法。

1.2 屠宰监测

在屠宰检查时，利用“肺部病变评分”系统评价猪群呼吸道疾病，是评估地方性肺炎发病率及其对胴体市场价格影响的常用方法。据估计，为了准确测量1个猪场的肺炎发病率和严重程度，至少需要检查30头猪的肺脏。这种方法对于检查在育肥阶段影响生产的亚临床疾病也很有帮助。然而，地方性肺炎病变并不是猪支原体感染所特有的，因为其他病原（比如猪流感病毒）也能产生类似病变。

通过屠宰场监测，回顾性分析地方性肺炎的发病率，这种方法的局限在于只能确认生产阶段后期的慢性肺脏病变，并不能提供关于育肥猪动态的呼吸系统健康信息。同样，其他细菌感染，如传染性胸膜肺炎，导致严重的胸膜炎而掩盖了地方性肺炎的病变。病变消除可能造成检测的假阴性结果，或者对早期支原体病得出1个模棱两可的诊断结果。表1中总结了屠宰场监测最常用的肺脏病变评分系统。视觉评估肺脏实变比例带有主观性以及损伤诊断缺乏特异性，限制了屠宰场监测方法的应用，因此需要其他验证方法。

表1 屠宰场监测地方性肺炎所用评分系统汇总

1.3 细菌培养

通过细菌培养从感染肺脏中分离猪支原体，被认为是诊断猪支原体的“金标准”，但是分离病原需要特殊的Friis培养基。SØrensen等比较了监测猪支原体的几种方法：细菌培养、免疫荧光（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和PCR，发现细菌培养是最敏感的方法，特别是在地方性肺炎感染后期只有少量猪支原体存在的时候。然而，猪支原体培养是费力费时的（从临床样品中分离需要4～8周时间），而且培养基上经常长满猪鼻支原体或絮状支原体。

1.4 猪支原体感染的血清学检测

血清学试验经常被用来监测猪群健康状况。猪支原体抗体的检测可以通过ELISA，少数情况下使用补体结合实验。猪群的支原体抗体需要应用ELISA方法对不同生长阶段的猪群进行同步检测（横向研究）或者对整个生产周期中的某一猪群进行检测（纵向研究）。在这种情况下，ELISA方法是一种快速、廉价且易于自动化的方法，在测定母源抗体和获得性抗体水平、猪群血清转阳所需时间方面，都提供了有用的信息。阻断ELISA（IDEI，猪支原体EIA试剂盒，Oxoid）和两个间接ELISA试验（Herdcheck，IDEXX和Tween 20-ELISA）是最常用的检测猪支原体血清抗体的方法。对于这些试剂盒的特异性和敏感性，也有学者比较研究报道过。当血清学检测结果出现不一致时，针对不同猪支原体抗原的蛋白印迹分析（WBI）可被用作确证试验。支原体抗体的实用性受到下列5个因素干扰：ELISA结果的差异（取决于检测所用的方法）；血清学检测不能区分自然感染和疫苗接种抗体；不同测量方法的抗体滴度之间缺乏相关性；不同毒株猪支原体导致的抗体差异；猪群血清转阳时间的显著差异。

自然条件下猪支原体血清转阳较实验条件下缓慢，不过猪经气管内感染肺炎支原体后2～4周，可以检测到抗体。SØrensen等报道，在经空气感染的猪群中，尽管一部分猪只最早在感染后8天就血清转阳，但其他的猪群需要再经过5周时间才会转阳。在自然条件下，Morris等发现，猪群在接触感染后3周，就出现血清转阳，抗体滴度在感染后11周达到高峰。在另外两项田间试验中，血清转阳主要发生在生长育肥猪单元（8～24周阶段），在感染后6～9周时间。猪支原体感染后血清转阳延迟，部分原因在于支原体吸附在呼吸道纤毛上皮细胞上，并不像其他病原那样入侵到肺脏组织。这可能导致支原体抗原较缓慢地递呈给宿主细胞。此外需要注意的是支原体抗体滴度和抗支原体感染的保护力无关。

1.5 猪支原体抗原的检测

尽管免疫组化（IHC）和IFA试验能特异性地检测出肺组织切片或者涂片中猪支原体，但这些技术的缺点是诊断只能在动物死后进行。而且，使用这些技术时只能检测小块的肺脏样品，如果样品中不含有呼吸道组织，这就增加了假阴性结果的风险。另外，检测的敏感性可能因为组织样品处理不当而大打折扣。如果多抗与其他的支原体紧密相关，这些检测方法中使用的抗体质量也可能限制了其特异性。

虽然通过IHC，利用特异性的单抗或多抗检测福尔马林固定、石蜡包埋的肺脏切片中的猪支原体，可以让病理学家把支原体抗原的出现和地方性肺炎损伤关联在一起，但这项技术由于灵敏度低，并不是实验室诊断的常规技术。直接和间接IFA已被用于定位猪肺脏中的支原体抗原。在致病机制和传播研究的诊断中，也有人将IFA和PCR方法做了对比。当动物体内支原体载量较高时，IFA的阳性结果和地方性肺炎较急性感染阶段相关；当动物体内支原体载量较低时，与该方法在其他慢性疾病中较低的灵敏度不同。IFA方法进一步的局限性在于使用冰冻切片时，人工组织碎片可能遮蔽形态学特征。

2 分子诊断方法

2.1 原位杂交

原位杂交用来检测和特异性定位经福尔马林固定、石蜡包埋的在自然和实验条件下感染的猪的肺脏组织中的支原体DNA。这项技术采用地高辛标记的特异探针，靶基因是支原体基因组的重复序列。荧光标记的寡核苷酸探针定位的16S核糖体DNA序列，也被用来鉴定猪支原体、猪滑液支原体和猪鼻支原体的种特异性。原位杂交方法的缺点是需要动物死后的解剖样本，而且此方法相对耗时，因此并不适用于快速诊断。

2.2 PCR

表2列出了用于检测不同样本中猪支原体DNA的PCR检测方法。这些方法比细菌培养更迅速而且价格相对低廉。然而，PCR方法样品污染也比较严重。考虑到支原体活的或死的DNA都可以扩增，PCR确定的阳性猪群是否是活跃感染就是个问题。因为支原体是吸附在气管纤毛的上皮细胞上，用PCR检测猪肺炎支原体最好的样品是气管-支气管拭子或者支气管肺泡灌洗液（BALF）。气管-支气管拭子和BALF同样可以预测活体和死后实验性感染猪的感染状况。利用PCR方法检测肺组织的猪支原体已经产生了差异较大的结论。Moorkamp等发现，在中等或严重的地方性肺炎病例中肺组织比BALF样品更适合，而Kurth等发现在这种环境下检测肺组织样品是不可靠的。

表2 已报道的基于PCR检测猪支原体的方法汇总

理想的情况下，一种检测活体动物体内病原的方法应该具备操作简便、快速且成本低廉的特点，而且能够提供数据支持控制措施的实施。尽管在理论上利用PCR检测活猪鼻腔内的支原体符合上述标准，但研究表明，经气管内进行支原体攻毒感染的猪上呼吸道内只有少量病原体存在，而且是间歇性地排毒。然而，采用PCR方法从鼻拭子中诊断自然感染被发现是可信的，而且鼻腔内猪支原体的检出和支气管内地方性肺炎造成的损伤是相关的。

尽管使用巢式PCR（n-PCR）检测活体内猪支原体的鼻拭子样本的潜力已被报道，但目前来看这项技术更适合用于猪群而非动物个体水平上支原体的监测。

利用PCR方法检测猪支原体，为确定猪群何时感染提供了一种更加精确的方法，因为血清转化需要时间，而这个时间长短差别较大。

2.3 分子分型技术

地方性肺炎临床发病过程的差异和支原体疫苗免疫效果的不一致，引起了人们对猪支原体分离株毒力不同的怀疑。

不同猪支原体分离株在抗原性、染色体组、基因组、蛋白质组等水平上均存在差异。Vicca等最终揭示了这些分离株的不同毒力特征。猪支原体在吸附和传播能力上的不同也被提及，但还没有得到清晰的证明。

表3 对猪支原体田间毒株基因进行分型的分子技术汇总

从流行病学角度看，对猪支原体分离株进行分型有助于理解支原体在猪群内和猪群间的传播。表3列出了最近描述的分子分型技术，指出一种毒株可感染某一特定猪群，而参与不同支原体感染的毒株也不尽相同。

译自：Sibila M,Pieters M,Molitor T,et al.Current perspectives on the diagnosis and epidemiology of Mycoplasma hyopneumoniae infection[J].Veterinary Journal,2009,181(3):221-231.