HBV感染慢性肝病患者血清microRNA-29表达水平及临床价值

冯兴华 牟建立 何泽宝

作者单位：浙江省台州恩泽医疗中心（集团）恩泽医院感染科（台州318050）

我国乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染已是严重公共卫生问题，临床统计显示，约25%～40%HBV感染者因肝脏反复发作慢性炎症进而发展为肝硬化或肝癌，但目前其发病机制尚未完全明确[1]。肝脏炎症以及慢性纤维化贯穿从HBV感染、慢性肝炎、肝硬化以至于肝癌过程中，然而目前既有的血清标志物对于评估肝脏炎症以及慢性纤维化程度准确度较差，因此，寻找简单易行且敏感性及特异性均较高的检测指标作为研究热点之一[2]。近年发现的微小RNA（micro RNA）是一类具有调控基因表达的RNA分子，参与细胞增殖与凋亡等多种病理生理过程，其中microRNA-29已被证实与纤维化病变紧密相关且在肝脏细胞中表达最高[3]。然而目前microRNA-29在HBV感染慢性肝病诊断中的临床研究报道尚不多见，且部分研究结果存在争议。因此本研究对不同类型HBV感染慢性肝病患者外周血microRNA-29的表达水平进行检测，探讨microRNA-29在评价HBV感染慢性肝病中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月—2017年6月我院就诊的170例HBV感染慢性肝病患者作为研究对象，其中男91例，女79例，平均年龄（52.9±12.4）岁，均签订知情同意书，本研究经我院伦理委员会审核通过。入选标准：（1）慢性乙型肝炎诊断及轻、中、重度的临床分级标准依据中华医学会肝病学分会与中华医学会感染病学分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南》（2010年）[4]以及《病毒性肝炎防治方案》（2000年）[5]；（2）肝癌（HCC）诊断依据第 4届全国肝癌学术大会讨论通过的原发性肝癌诊断标准[6]；（3）研究前半年内未使用抗病毒治疗或免疫调节剂；（4）临床资料齐全。排除标准：（1）同时合并或重叠感染其他非HBV病毒性肝炎；（2）罹患药物、酒精、化学物质等因素引起的肝炎以及自身免疫性肝病；（3）罹患有严重心肺肾等重要器官功能不全；（4）罹患糖尿病合并症或免疫缺陷性疾病。

1.2 分 组 本研究对象根据临床诊断分为四组慢性 HBV 携带（hepatitis B virus carriers，ASC）组，35例；慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）组，80例，根据病情程度再分为三个亚组：轻度25例、中度30例、重度25例；乙型肝炎肝硬化（liver cirrhosis，LC）组，30 例；肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）组，25例；另选择同期健康体检者（healthy control，HC）30名作为健康对照组。以上各组在性别比、年龄、体质量指数（BMI）、既往内科疾病史相比无显著性差异（P 均>0.05），见表 1。

表1 各组研究对象一般情况比较

1.3 血清microRNA-29检测

1.3.1 总RNA提取及鉴定 各组研究对象均在清晨空腹自肘静脉采集5mL静脉血，应用Trizol试剂（购自美国Norgen公司）提取样本血清中的RNA，并保存于-70℃待检。RNA完整性应用1%变性琼脂糖凝胶电泳检测确定，RNA浓度和纯度应用NanoDrop ND1000检测确定。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测 cDNA合成：总反应体系为 20μL，包括 dNTP 2μL、1×RT Buffer 2μL、RT 特异引物 0.3μL、Total RNA 200μg 2.5U/μL、Poly A Polymerase 1μL、RT mix 1μL、无 RNA 酶水补足至 20μL。反应条件为：16℃，30min；42℃，40min；85℃，5min。

实时定量PCR：总反应体系体积为10μL，包括：2×Master Mix 5μL、10μmol/L 的 PCR 特异引物 F 0.5μL、10μmol/L 的 PCR 特异引物 R 0.5μL、加水至8μl，混合离心后再加入 2μl已合成的 cDNA。microRNA-29的扩增引物序列为：上游引物（F）：5’GCGCGCTAGCACCATTTG-3’，下游引物（R）：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，反应条件为：95℃，2min；40 个 PCR 循环（95℃，10s；60℃，40s）。

本研究检测所用PCR热循环仪购自德国Eppendoff公司、实时荧光定量PCR仪购自美国ROCHE公司Indianapolis；反转录试剂及所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 microRNA-29表达水平计算 microRNA-29表达Ct值（反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）：△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因（其值越大，即表达量越低），△△Ct=△Ct试验组-△Ct对照组，目的基因表达量=2-△△Ct。

1.4 临床生化及病毒指标检测 应用生化自动分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）；应用化学发光法测定甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）；采用双抗体夹心法检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）；采用荧光定量PCR检测HBV DNA水平。

1.5 统计学方法 应用SPSS21.0软件，计量资料数值以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采取ANOVA检验，两组组间比较采用SNK检验；计数资料以百分率表示，采取χ2检验。应用Pearson相关分析血清microRNA-29表达水平与血清ALT、HBsAg、HBV DNA以及AFP水平的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清microRNA-29表达水平比较 各组血清microRNA-29相对表达量存在差异，HC组及ASC组＞CHB组＞LC组＞HCC组（P均＜0.05）；在CHB组的三个亚组也存在差异，重度＞中度＞轻度（P均＜0.05），见表 2。

2.2 Pearson相关分析 应用Pearson相关分析，CHB组与LC组患者血清microRNA-29相对表达量与血清HBV DNA以及HBsAg水平呈负性相关（P均＜0.05）；HCC组患者血清microRNA-29相对表达量与AFP血清水平呈负相关（r=-0.817，P=0.013）；ASC组、CHB组、LC组及HCC组血清microRNA-29相对表达量与血清ALT水平均无相关关系（P均＞0.05），见表 3。

表2 各组血清microRNA-29表达水平比较（±s）

表2 各组血清microRNA-29表达水平比较（±s）

组别ASC组CHB组重度中度轻度LC组HCC组HC组F值P值例数35 80 25 30 25 30 25 30 Ct 16.2±1.5 19.2±2.1 17.4±1.6 18.7±2.2 19.9±2.3 24.5±2.7 26.8±2.0 15.6±1.8 4.887 0.035 2-△△Ct 38.6±4.8 21.1±3.6 23.6±3.2 21.6±2.9 19.2±3.8 8.7±2.1 3.5±1.4 40.5±3.5 6.053 0.001

表3 各组血清microRNA-29水平与不同临床指标Pearson相关分析

3 讨论

研究[7]发现，microRNA在HBV感染慢性肝病患者体内的病毒复制、肝纤维化进展以及肝癌发生和转移机制中可能起重要调节作用，与慢性肝病发生、发展、治疗及预后之间存在密切相关性。研究证实，肝脏组织细胞以及循环血液中均能检测出microRNA，其中血清microRNA-29水平已被证实是一种非侵入性肝特异性诊断标志物，能用于慢性肝病的早期诊断、分期、监测以及预后判断，包括评估病毒感染程度、纤维化程度、肝癌发生等[8-9]。

慢性HBV感染可导致microRNA-29的表达水平降低，且与慢性持续性感染和疾病进展有负相关性，提示其可能作为保护因子抑制慢性肝病病情的发展[10]。研究[11-12]证实，血清 microRNA-29在 HBV 感染慢性肝病和肝癌患者中均降低，被认为作为肝组织损伤标志物具有较好的敏感性和特异。在人肝星状细胞中转染microRNA-29b研究中显示，其能明显减轻TGF-β1刺激引起的胶原蛋白I mRNA和蛋白的表达水平，提示microRNA-29b具有抗纤维化作用[13-14]。因此，有研究者认为，探讨HBV感染慢性肝病患者体内血清microRNA-29水平的变化规律，不仅有助于进一步阐明慢性HBV感染的机制，而且为临床早期诊断和抗病毒治疗疗效评价提供新的分子标记物[15-16]。

本研究发现，microRNA-29表达水平在健康对照组和慢性HBV携带者最高，慢性乙肝患者次之，肝硬化患者低于慢性乙肝患者，肝癌患者最低，同时慢性乙肝患者中随着病情加重microRNA-29表达水平也在逐步降低，这说明HBV感染慢性肝病患者血清microRNA-29水平已经较正常人群降低，而随着HBV感染从慢性乙肝向肝硬化失代偿期以及肝癌的进展过程中，外周血microRNA-29水平呈现逐步降低，提示microRNA-29可能作为抑癌基因参与慢性乙肝向肝硬化以及肝癌发展整个病理过程。

本研究结果显示，血清microRNA-29表达水平与HBV DNA血清水平呈正相关，随着慢性乙肝患者病情加重，血清microRNA-29表达水平降低，病毒复制加剧，病毒载量水平会有不同程度提高。同时慢性乙肝患者血清HBsAg的水平与血清microRNA-29表达水平也呈负相关，血清HBsAg水平己被证实与慢性肝病的进展相关，因此血清microRNA-29对慢性乙肝患者病情进展有抑制作用，并能评估病情严重程度。本研究结果显示，肝癌患者血清microRNA-29相对表达量与AFP血清水平呈负相关，提示高血清AFP水平可能是肝癌组织microRNA-29低表达的体现，这对评估肝癌治疗疗效及预后评价有重要意义。ASC组、CHB组、LC组及HCC组血清microRNA-29相对表达量与血清ALT水平均无相关关系，这也提示肝功能水平影响因素较多，不能直接体现HBV感染慢性肝病患者病情进展情况。

综上所述，microRNA-29是一种肝脏特异性miRNA，与HBV DNA、HBsAg以及AFP有显著负相关性，提示microRNA-29能对HBV感染慢性肝病炎症程度以及肝癌的病情进行评估，可能是一种具有临床潜在应用价值的肝脏损伤标志物。