制备液相色谱法分离纯化碘帕醇

李华军, 陈 茜

(浙江司太立制药股份有限公司, 浙江 台州 317300)

碘帕醇是一种非离子型水溶性碘造影剂,具有良好的显影作用,对血管壁及神经组织毒性小,不良反应少,性质稳定,适用范围广,主要用于神经放射学、血管造影术、泌尿系统造影术、CT检查中增强扫描、关节造影术、数字减影血管造影术[1-3]。美国药典(USP)40版[4]、欧洲药典(EP)9.0版[5]和日本药典(JP)17版[6]均收录了此品种。

碘帕醇分离纯化困难,原因在于粗品中含有较多结构相似的杂质(A～K结构见图1[5])。美国药典[4]和欧洲药典[5]都对其含量做了严格的限定。EP 9.0版[5]规定,有关杂质A、B、C、D、E、F、G、J和K的单一杂质峰面积不得高于总峰面积的0.1% ,有关杂质H和I的峰面积之和须小于总峰面积的0.5% 。关于碘帕醇的分离纯化研究报道相对较少[7,8]。目前,碘帕醇生产中使用大孔吸附树脂吸附法,该方法生产周期长,分离柱效低,自动化程度不高,工艺稳定性不好,不利于产品质量的控制[9]。同时,树脂再生还会产生大量的废水,不利于环保。因此,发展一种快速、稳定、高效、环保的分离纯化技术是相关生产厂家的迫切需求。

高效液相色谱法采用粒度均匀的小颗粒填料,具有高于大孔树脂的柱效,同时可采用自动化的仪器设备实现精确流速和在线监测。在碘帕醇的工业生产上使用这种更加先进的分离技术,可有效提高其生产水平。本文基于HPLC技术,分别考察了固定相种类、柱温和上样量对样品分离的影响,并将优化后的条件放大到制备水平上,对碘帕醇料液进行分离纯化。同时考察了各个杂质的分布和收集策略,在保证高回收率的条件下,获得高纯度的碘帕醇样品。

图 1 碘帕醇及其相关杂质结构[5]Fig. 1 Structures of iopamidol and its related substances[5]

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

碘帕醇料液及馏分分析采用Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色谱系统(美国Agilent公司);碘帕醇料液纯化采用动态轴向加压纯化系统DAC-HB50(江苏汉邦科技有限公司)。

色谱条件优化中采用的两款不同键合量C18填料均购于浙江华谱新创科技有限公司,粒径10 μm,孔径10 nm,键合量(含碳量)分别为13.7%(C18-1)和11.5%(C18-2),装填250 mm×4.6 mm的色谱柱。

碘帕醇及制备馏分分析所用乙腈和超纯水均为美国Sigma-Aldrich色谱纯溶剂。分析柱为Zorbax SB-phenyl (250 mm×4.6 mm, 5 μm),购于美国Agilent公司。

碘帕醇料液纯化所用甲醇为工业甲醇,水为纯化水(车间自制)。

碘帕醇料液由浙江司太立制药股份有限公司车间合成,碘帕醇色谱纯度为86.16% 。

1.2 色谱条件

碘帕醇料液的纯化:制备料液为碘帕醇车间生产料液,经外标定量后测定的碘帕醇质量浓度为230 g/L。制备水平采用与分析条件优化时相同的固定相C18-1(10 μm);称取330 g,装填制备柱(制备柱型号为DAC-HB50,内径为50 mm),装填高度约270 mm。流动相A为水,B为甲醇。线性梯度洗脱:0～60.0 min, 100%A; 60.0～60.5 min, 100%A～20%A; 60.5～80.0 min, 20%A。流速:60 mL/min;柱温:20 ℃;检测波长:240 nm;碘帕醇料液的进样体积:6.5 mL;收集方式:36～60 min收集8个馏分(见表2)。

碘帕醇料液及制备馏分中杂质的分析:采用EP 9.0版[5]规定的碘帕醇有关物质的液相色谱测定方法,对料液和纯化后的各个馏分进行分析,具体方法如下。Zorbax SB-phenyl色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相A为水,B为乙腈-水(50∶50, v/v)。线性梯度洗脱:0～18 min, 100%A; 18～40 min, 100%A～62%A; 40～45 min, 62%A～50%A; 45～50 min, 50%A～100%A; 50～60 min, 100%A。流速:2.0 mL/min;柱温:60 ℃;检测波长:240 nm;进样体积:20 μL。

2 结果与讨论

2.1 样品杂质分析

碘帕醇料液中碘帕醇有关物质的色谱图见图2,碘帕醇的色谱纯度为86.16% 。按照文献[5]规定的相对保留时间(RRT)比对各个杂质(见表1)。杂质I和H、K、C、J、A、E、F的色谱峰面积百分比分别为0.28% 、0.11% 、0.13% 、0.10% 、0.35% 、0.40% 、0.37% 。另外,色谱峰面积百分比超过0.1%的杂质还有7个,RRT分别为:0.21、0.25、0.52、2.25、2.45、2.74,对应的色谱峰面积百分比分别为:7.86% 、1.60% 、0.68% 、0.10% 、0.11% 、0.12% 、0.14% 。可见,碘帕醇料液未达到杂质限量要求[5],需对料液做进一步的纯化,降低杂质含量。

图 2 碘帕醇料液中有关物质的色谱图Fig. 2 Chromatogram of iopamidol related substances in crude iopamidol solution Column: Zorbax SB-phenyl (250 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase: water (A), water-acetonitrile (50∶50, v/v)(B). Gradient: 0-18 min, 100%A; 18-40 min, 100%A-62%A; 40-45 min, 62%A-50%A; 45-50 min, 50%A-100%A; 50-60 min, 100%A-100%A. Flow rate: 2.0 mL/min; column temperature: 60 ℃; injection volume: 20 μL; detection wavelength: 240 nm. Peak names are the same as those in Fig. 1.

Compound names are the same as those in Fig. 1. The retention time of iopamidol in Ref. [5] is about 14.6 min.

2.2 用于纯化制备的液相色谱条件的优化

碘帕醇是一种极性较强的化合物,在传统C18固定相上保留较弱,不易与杂质分离。本实验选择了两款不同键合量的C18固定相(C18-1和C18-2),均具有良好的水浸润性,能在纯水条件下使用[10,11]。故实验以水作为流动相,比较了碘帕醇在这两种固定相上的分离情况。如图3所示,碘帕醇在C18-1上的保留(容量因子(k)=13.11)强于C18-2(k=8.73)。因此,实验选择C18-1作为碘帕醇料液分离纯化的固定相,纯水作为初始流动相。此外,使用纯水作为碘帕醇的洗脱溶剂有利于碘帕醇样品的溶解,满足后续的放大生产要求,也体现了经济环保的特点。

图 3 碘帕醇料液在C18-1和C18-2固定相上的色谱图Fig. 3 Analytical chromatograms of the crude iopamidol solution on stationary phases C18-1 and C18-2 Mobile phase: water (A), methanol (B). Gradient: 0-60.0 min, 100%A; 60.0-60.5 min, 100%A-20%A; 60.5-80.0 min, 20%A. Flow rate: 0.5 mL/min; column temperature: 20 ℃; injection volume: 2 μL; wavelength: 240 nm.

柱温是HPLC的一个重要条件,它对k值存在明显的影响[12-14]。根据Van’t Hoff方程,大多数溶质分子的保留会随着温度的变化而变化,且可用公式(1)表达:

logk=A+B/T

(1)

对于特定的溶质分子,A和B是独立于温度的常数,T代表温度(K)。实验考察了柱温为15、20、25和30 ℃时碘帕醇保留的变化。如图4所示,随着柱温的升高,碘帕醇的保留逐渐减弱,分离效果变差。将保留因子与柱温按式(1)进行拟合,可得:logk=0.002 1+0.001 1/T,线性相关系数R2=0.999 2,结果表现出良好的线性关系。较低的柱温有利于样品的分离,然而对于生产来说温度过低,生产周期增长,生产效率降低,同时能耗也会增加。因此,选择温度为20～25 ℃对于生产控制是较为合适的。

图 4 柱温对料液中碘帕醇保留的影响Fig. 4 Effect of column temperature on the retention of iopamidol Column: C18-1 (250 mm×4.6 mm, 10 μm); column temperature: (a) 30 ℃, (b) 25 ℃, (c) 20 ℃, (d) 15 ℃; injection volume: 50 μL. Other conditions are the same as Fig. 3.

上样量在制备色谱中也是一个关键因素。随着上样量增加,色谱峰变宽,从而可能影响主峰与杂质的分离度,降低制备样品的纯度[15,16]。本实验在0.23～23 mg范围内考察了上样量对峰形变化的影响(见图5)。当上样量为0.23 mg时,主峰峰形呈现良好的对称性(对称因子为1.10)。随着上样量增加,色谱峰向前展宽。当上样量增加到一定程度时,前杂会与主峰发生交叉,影响主峰纯度。因此在放大制备过程中要选择合适的上样量,以便获取高纯度的样品。

图 5 上样量对碘帕醇峰形的影响Fig. 5 Effect of loading amount on peak shape of iopamidol Column: C18-1 (250 mm×4.6 mm, 10 μm). Other conditions are the same as Fig. 3.

2.3 样品的制备

在4.6 mm内径的分析柱上进行条件优化后,在DAC50纯化系统上开展了放大制备实验,制备条件见1.2节,制备谱图如图6所示。

图 6 碘帕醇的制备色谱图Fig. 6 Preparative chromatogram of iopamidol Column: C18-1 (270 mm×50 mm, 10 μm); flow rate: 60 mL/min; injection volume: 6.5 mL. Other conditions are the same as Fig. 3.

碘帕醇料液在制备水平同样得到了较好的分离。为了进一步考察碘帕醇主峰(保留时间为36～60 min)与有关杂质的分离情况,对该时间段的样品进行了分段收集,共获得8个馏分,直接进液相色谱检测。HPLC结果显示,杂质K、杂质C和杂质A均未检出,杂质I和H、杂质J、杂质E和杂质F在各个馏分中的色谱峰面积百分比与原料相比都有显著的降低(见表2)。

54～58 min和58～60 min两个馏分中,杂质J的色谱峰面积百分比都超过了0.1% 。因此,本文将保留时间36～54 min的馏分合并,进行HPLC检测, 有关杂质A、B、C、D、E、F、G、J、K均未检出,杂质I和H的峰面积百分比为0.22%(见图7),相关物质含量符合限量规定(杂质I和H<0.5% ,杂质J、E、F<0.1% )。对该馏分进行回收率计算,结果表明碘帕醇的色谱纯度为98.97% ,碘帕醇的回收率可达93.44% 。经过制备HPLC纯化,可以在保证高回收率的条件下有效降低杂质水平。

图 7 合并馏分(36～54 min)的分析色谱图Fig. 7 Analytical chromatogram of combined fractions (36-54 min) Injection volume: 40 μL; other conditions are the same as Fig. 2.

3 结论

本实验基于制备液相色谱法,考察不同色谱固定相、柱温及上样量对碘帕醇的保留与分离的影响,优化碘帕醇分离纯化参数,并放大到制备水平,考察碘帕醇的纯度及杂质分布情况,得到了高纯度的碘帕醇样品。所得样品质量稳定可控、关键杂质指标均在合格范围内。与现有的大孔吸附树脂纯化工艺相比,该方法具有高效、稳定、快速等特点,而且对碘帕醇杂质的去除效果好,回收率高,可以为碘帕醇分离纯化生产工艺的开发提供新的思路。