QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法检测羊肉中8种抗真菌药

张 凯, 秦 宇, 卞 华, 曹 慧, 刘天益, 葛 宇*

(1. 上海理工大学医疗器械与食品学院, 上海 200093; 2. 上海市质量监督检验技术研究院, 上海 200233)

抗真菌药(antifungal drugs)泛指一些能抑制或灭杀真菌的药物,是治疗真菌感染疾病的合成抗菌药。目前,世界上约有80种抗真菌药用于临床治疗[1,2],按化学结构大致分为棘白菌素类、多烯类、嘧啶类、丙烯胺类和唑类,根据作用部位分为外用药和内服药。

抗真菌药的发展大致可分为3代:第1代,1939年,研究者从微生物青霉菌发酵代谢产物中分离得到灰黄霉素(griseofulvin),用于抑制皮肤癣菌[3];第2代为咪唑类,主要包括1981年在美国上市的酮康唑(ketoconazole)口服制剂、克霉唑(clotrimazole)、咪康唑(miconazole)、益康唑(econazole);第3代为三唑类,包括1990～1992年开始在美国使用的氟康唑(fluconazole)和伊曲康唑及1995～1996年上市的烯丙胺类药物特比萘芬等。新抗真菌药的研究和开发主要集中在降低药物的毒副作用、对唑类药物进行优化和开发、筛选新结构和新作用机制的药物[4],但目前新发现的多数抗真菌药存在抗真菌普过窄、体内活性微弱或细胞毒性较强的问题[5]。

目前只有10种多烯类、嘧啶类和唑类的抗真菌药被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于人体全身性真菌治疗[6]。有关抗真菌药检测方法的研究也主要集中于人用药物,如近年来建立了液相色谱-串联质谱法测定抗真菌药在乳膏等药剂中的含量，以及在人体血浆和尿液中的残留量[7-9]。李力等[10]采用HPLC-MS/MS法测定了人体血浆中泊沙康唑的含量;彭博等[11]采用HPLC法测定了复方克霉唑乳膏中二丙酸倍他米松和克霉唑的含量。关于食品基质中抗真菌药测定的研究较少,Othman等[12]建立了测定牛奶样品中唑类抗真菌药的HPLC法。该方法前处理过程复杂且基质干扰较强,不适于处理批量样品，且易出现假阳性结果。

研究过程中发现,部分羊肉中存在氟康唑、咪康唑和酮康唑等抗真菌药的残留,然而国内外均未开展肉类产品中此类抗生素检测方法的研究,已发布的标准与法规对此类化合物也未作涉猎。我国现行的农业部235号公告(动物性食品中兽药最高残留限量(MRL))对抗真菌药在畜禽养殖过程中的使用限量均未作规定,只在2015年版中华人民共和国兽药典中提及抗真菌药中的水杨酸及其软膏制剂可用于兽药临床的治疗。

本文借鉴化妆品安全技术规范(2015版)《液相色谱-串联质谱法测定化妆品中氟康唑等9种组分的含量》[13],拟利用QuEChERS技术进行快速前处理,建立了超高压液相色谱-串联质谱检测羊肉中8种抗真菌药残留的方法。该法可为食品中抗真菌药检测方法的建立提供可靠的技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

QTRAP 6500三重四极杆串联质谱仪,配有电喷雾电离(ESI)源、Analyst仪器控制及数据处理软件(美国AB Sciex公司);超高效液相色谱仪,包括G4200A流动相输送泵、G4226A自动进样器、G1316C柱温箱(美国Agilent公司); MSZO4S/Z型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司); Centrifuge 5804高速离心机(德国Eppendorf公司)、D-91126多管涡旋振荡器(德国Heidolph公司)、Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)甲醇、乙腈(色谱纯,美国Thermo Fisher公司);甲酸(色谱纯,美国ACS公司);醋酸铵(国药集团化学试剂有限公司); QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管、MgSO4粉包、50 mL陶瓷均质子(美国Agilent公司);实验室用水为超纯水。

标准品:克霉唑、萘替芬(natifine)、联苯苄唑(bifonazole)、咪康唑、酮康唑、益康唑、氟康唑、灰黄霉素,纯度均≥98% ,均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。

羊肉样品均采自上海市农贸市场,其中崇明区80批次、金山区30批次、奉贤区20批次。

1.2 标准溶液的配制

准确称取8种抗真菌药各10.0 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中,配制成100.0 mg/L 的标准储备液,于-18 ℃保存;分别移取适量标准储备液,用3.0%(v/v)乙腈水溶液稀释,配制成1.0 mg/L 混合中间液;使用时根据需要用相应的空白样品基质提取溶液配制适当浓度的标准工作溶液。

1.3 样品前处理

1.3.1提取

准确称取均质后的试样5.00 g(精确至0.01 g),置于50 mL具塞离心管中,加入2.0 mL纯水与两粒陶瓷均质子,涡旋2 min至试样呈灰白色;加入10.0 mL 2.0%(v/v)甲酸乙腈溶液,涡旋5 min,以 9 000 r/min 离心3 min。

1.3.2净化

取5.0 mL 5 mmol/L 乙酸铵水溶液,移至QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管中进行活化,涡旋2 min;移取离心后的上层提取液5.0 mL,转移至活化好的净化管中,涡旋2 min,以 9 000 r/min 离心3 min。

1.3.3反萃

将净化离心后的上层液转移至含有两粒陶瓷均质子的50 mL具塞离心管中,快速倒入MgSO4粉包,涡旋2 min,以 9 000 r/min 离心3 min,取1 mL离心后的溶液过0.22 μm聚四氟乙烯(PTFE)滤膜,供UPLC-MS/MS检测。

1.4 分析条件

色谱柱:Atiantis®T3柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm);柱温30 ℃;样品室温度15 ℃;流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液;流动相B:乙腈;流速:0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0～1 min, 3%B; 1～5 min, 3%B～50%B; 5～6 min, 50%B～95%B; 6～7 min, 95%B; 7～8 min, 95%B～3%B; 8～9 min, 3%B。进样体积:5 μL。

离子源:电喷雾电离源,正离子模式(ESI+);扫描方式:多反应监测(MRM);离子源温度(TEM): 350 ℃;电喷雾压力(IS): 5 500 V;气帘气压力(CUR): 0.28 MPa;雾化气压力(GS1): 0.34 MPa;辅助气压力(GS2): 0.41 MPa。8种抗真菌药物的监测离子对(Q1/Q3)、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)见表1。

表 1 8种抗真菌药的质谱参数

* Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

8种目标化合物属咪唑类、三唑类、多烯类等抗真菌药,化学结构差异较大,使用等度洗脱较难实现理想的分离效果。本实验采用Atiantis®T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm)对目标物进行梯度洗脱,同时考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水作为流动相时,目标物的分离效果和色谱峰形。结果表明,采用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水时,抗真菌药物的离子化效率较高,目标化合物分离效果与峰形良好,质谱响应最优。因此,本实验采用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相。

2.2 质谱条件的优化

配制1.0 mg/L 8种抗真菌药的混合标准溶液,采用注射泵直接进样的方式注入质谱仪。采用ESI+扫描方式进行一级质谱分析,确定母离子[M+H]+,优化DP。对母离子进行二级质谱扫描,优化CE,选取相对丰度较高且稳定的两个特征碎片离子作为定性、定量离子,以满足欧盟657/2002/EC指令对禁用药物定性检测的规定,即满足1个母离子和至少2个子离子共4个识别点数的要求。本实验8种抗真菌药的质谱参数见表2。图1为8种抗真菌药物在该分析条件下的多反应监测色谱图。

表 2 羊肉中8中抗真菌药的线性方程、相关系数(R2)、检出限、定量限和基质效应

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

图 1 8种抗真菌药的多反应监测色谱图Fig. 1 Chromatograms of the eight antifungal drugs in MRM mode

2.3 前处理条件的优化

2.3.1提取溶剂的优化

乙腈极性范围宽,组织穿透能力强,对糖、脂肪、蛋白质类化合物的提取率低,同时对多数目标化合物有较好的溶解性和较高的提取效率;乙酸乙酯的极性相对较弱,毒性较低,二者均是较为理想的提取溶剂。降低提取溶剂的pH值能够有效破坏基质的组织结构,使目标物质从组织结构中游离出来。本实验针对羊肉样品比较了采用乙酸乙酯、乙腈、含1.0%(v/v)甲酸的乙腈和含1.0%(v/v)甲酸的乙酸乙酯4种提取溶剂时8种目标化合物的提取效率(见图2)。为展现不同提取溶剂对目标化合物在羊肉基质中回收率的影响,8种抗真菌药所得的回收率均由溶剂曲线校正。结果表明,乙酸乙酯对除灰黄霉素、克霉唑和氟康唑以外的其他5种抗生素的提取效率均不理想,采用含1.0%(v/v)甲酸的乙酸乙酯作提取溶剂时这5种化合物的提取效率仍无明显改善;乙腈作为提取溶剂时,8种抗真菌药的平均回收率均低于10.0% ,但采用含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂时,目标化合物的平均回收率显著提升。

为减弱基质效应(ME)对实验结果的影响,实验考察了在基质匹配曲线的校正下,甲酸在乙腈中的体积分数对目标化合物提取效率的影响(见图3)。结果表明,随着甲酸体积分数的增加,目标化合物的回收率均有所增加,当采用含2.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液提取时,8种抗真菌药平均回收率为99.9% 。随着甲酸体积分数的继续增加,目标化合物的回收率急剧下降,可能是因为酸的含量过高,导致基质发生胶化。因此,本实验选用含2.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂。

图 2 不同提取溶剂对羊肉样品中8种抗真菌药回收率的影响Fig. 2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of the eight antifungal drugs in mutton samples

图 3 甲酸在乙腈中的体积分数对羊肉样品中8种抗真菌药回收率的影响Fig. 3 Effect of volume fractions of formic acid in acetonitrile on the recoveries of the eight antifungal drugs in mutton samples

2.3.2提取方式及时间的优化

超声波具有极端的物理特性,能促使基质组织破壁变形;涡旋有利于提取溶剂与基质的充分混合,有助于目标化合物的溶解。实验考察了超声波提取(5、10、20 min)和涡旋提取(1、2、5 min)对提取效率的影响。结果表明,超声提取5 min和涡旋提取2 min均可获得较好回收率,但考虑到批量处理样品的可操作性,最终选择涡旋提取2 min。

2.4 方法学评价

2.4.1基质效应

基质效应是指基质成分和目标化合物在进行离子化时相互竞争而导致目标化合物信号强度有不同程度的增强或减弱的现象，包括基质增强效应和基质抑制效应。尽管样品经过沉淀蛋白、分散固相萃取后取得了良好的净化效果,但仍无法完全消除基质效应,而基质效应的存在会对检测结果的准确性产生影响。因此,在建立LC-MS/MS检测方法时应对基质效应进行评价,并采取消除措施,以保证结果的准确、可靠。

基质效应可采用(基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1)×100%进行评价(见表2),负值表示存在基质抑制效应,正值表示存在基质增强效应,绝对值越大则基质效应越强[14]。由表2可知,羊肉对8种抗真菌药物均存在很强的基质抑制效应,为了减弱基质效应对检测的影响,实验采用基质匹配曲线来确定方法的检出限。

2.4.2线性范围与检出限

按1.2节描述配制6个水平的基质匹配混合标准溶液,在选定的色谱条件和质谱参数下进行检测。以目标化合物定量离子的峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X, μg/L)为横坐标绘制工作曲线,8种抗真菌药的线性范围为0.2～50 μg/kg,相关系数≥0.997 8,线性关系良好。以定量离子信噪比(S/N)为3和10计算样品的检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果见表3。

2.5 回收率与精密度

按1.3节样品前处理方法,向空白基质中分别加入低、中、高3个水平的混合标准溶液进行加标回收率的测定(n=6)。结果表明,羊肉中8种抗真菌药的平均加标回收率为70.3% ～118.4% , RSD为0.4% ～4.3%(见表3)。

2.6 实际样品检测

应用所建方法对上海市农贸市场的羊肉产品(130批次)进行分析检测,其中,5批次样品检出氟康唑,含量分别为3.12、5.38、7.59、7.89和8.66 μg/kg,其余样品均未检出目标化合物。

3 结论

本实验建立了超高效液相色谱-串联质谱测定羊肉中8种抗真菌药的分析方法。该方法灵敏高效,回收率优良,重复性稳定,适用于羊肉样品抗真菌药物的检测,可为此类化合物检测标准的建立提供技术支持。