高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定血清中胆固醇及其6种代谢标志物

黄雯雯, 勾新磊, 胡铁靖, 胡光辉, 赵新颖

(北京市理化分析测试中心, 有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室, 北京 100094)

人体血液中的胆固醇(cholesterol)浓度是高血脂症的重要评价指标之一。人体内胆固醇的平衡主要通过内源性肝脏合成和外源性肠道吸收两个途径。其中,血清中2,4-脱氢胆甾醇(desmosterol)、7-烯胆甾醇(lathosterol)和角鲨烯(squalene)是固醇前体,是反映人体内源性胆固醇合成效率的胆固醇合成标志物;菜油固醇(campesterol)、豆固醇(stigmasterol)和β-谷固醇(β-sitosterol)源自膳食植物,是反映机体外源性胆固醇吸收效率的胆固醇吸收标志物[1-3],它们统称为胆固醇代谢标志物,其结构式见图1。血清中胆固醇的代谢标志物比胆固醇能更早地反映人体胆固醇的代谢状态[4,5],因此,准确测定血清中胆固醇及其代谢标志物的含量对血脂代谢异常的流行病学研究、临床降脂药物疗效评价及胆固醇代谢研究具有重要意义。目前我国临床常规检验血清中的胆固醇普遍使用酶法[6],同时测定胆固醇及其代谢标志物的行业标准方法尚无报道。血清中基质复杂,胆固醇代谢标志物的含量比胆固醇的含量更低,因此同时检测胆固醇及其代谢标志物必须具备高灵敏度和低检出限的优势。文献中报道的相关检测方法主要有气相色谱法(GC)[7-9]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[10-15]、液相色谱法(LC)[16]以及液相色谱-电喷雾质谱联用法(LC-ESI-MS)[17]。但是这些方法存在的主要问题是前处理复杂,样品均需经皂化及衍生处理后测定,操作繁琐,耗时较长,测量结果误差较大。

本文采用配有大气压化学电离源(APCI源)的高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-Q/Orbitrap HRMS)对血清中的2,4-脱氢胆甾醇、7-烯胆甾醇、胆固醇、菜油固醇、豆固醇、β-谷固醇和角鲨烯进行了定量检测。采用全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/dd MS2)监测模式,通过提取目标分子的一级质谱精确质量数同时获得定性和定量结果,通过自动触发获得的二级全扫描数据进一步提高定性的准确性。充分利用HPLC-Q/Orbitrap HRMS分辨率高、灵敏度高、检出限低和抗干扰能力强的特点,建立了一种前处理方法简单、分析时间短、测定结果准确的方法。

图 1 胆固醇及其6种代谢标志物的化学结构式Fig. 1 Chemical structures of cholesterol and its six metabolism markers

1 实验部分

1.1 仪器、材料和试剂

Dionex UltiMate 3000高效液相色谱-Q Exactive四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用系统(美国Thermo Fisher Scientific公司),配有APCI源;Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美国Waters公司); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司); XPE105电子天平(d=0.01 mg,瑞士Mettler Toledo公司); Research plus可调量程移液器(1 000 μL,德国Eppendorf公司)。

胆固醇(纯度≥99% )、7-烯胆甾醇(纯度≥99% )和2,4-脱氢胆甾醇(纯度≥84% )均购自Sigma公司,豆固醇(纯度>95% )、菜油固醇(纯度>98% )和β-谷固醇(纯度>98% )均购自J&K,角鲨烯(>98.0% )购自TCI公司,胎牛血清(优级纯)购自浙江天航生物科技有限公司。甲醇、乙腈(色谱纯)购自美国Merck公司。

血清样品来自某医院门诊体检合格者。早晨空腹抽血,经分离胶采血管分离,4 000 r/min离心,静置后取上层血清于-80 ℃中储存备用。

1.2 标准溶液的配制

分别称取对照品,用乙腈溶解、定容,制得质量浓度为 1 000 mg/L 的储备液,4 ℃保存(有效期30天)。分别移取各标准储备液于100 mL容量瓶中,用乙腈定容,配制成不同浓度的混合标准工作溶液,工作溶液在每次使用前制备。

1.3 样品前处理

血清使用之前于4 ℃冰箱中过夜解冻,移取血清样品400 μL于1.5 mL离心管中,加入4 ℃乙腈600 μL,涡旋1 min,超声5 min, 4 000 r/min 离心5 min,过0.22 μm滤膜到进样瓶中,上机测定(胆固醇的定量需稀释 10 000 倍,单独进样测定)。

1.4 仪器分析条件

色谱条件 Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流动相:80%(v/v)乙腈-20%(v/v)甲醇(A相)和水(B相);流速:0.4 mL/min;洗脱程序:95%A等度洗脱15 min;柱温:35 ℃;进样室温度:20 ℃;进样量:10 μL。

质谱条件 离子源:APCI源;扫描模式:正离子;监测模式:Full MS/dd MS2;扫描范围(m/z): 50～450;一级分辨率:70 000 FWHM;二级分辨率:17 500 FWHM;鞘气(N2)压力:3.45×105Pa:辅助气(N2)压力:3.45×104Pa;放电电流:4.0 μA;离子传输管温度:350 ℃;蒸发温度:350 ℃;自动增益:1×106; C-trap离子注入时间:50 ms;隔离窗口:m/z1.2;碰撞能:35 eV。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

7种目标物质均属于弱极性化合物,在C18色谱柱上强保留。根据相似相溶原理,流动相中有机相含量高,极性弱,洗脱能力强。实验考察了两种色谱柱X Bridge BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm, Waters)和Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters)以及不同极性的流动相组成(100%甲醇、100%乙腈、甲醇-乙腈(2∶8, v/v)、95%(v/v)的甲醇-乙腈(2∶8, v/v)-5%(v/v)水)对胆固醇及其6种代谢标志物分离情况的影响。实验结果表明,适当增加水的含量,可以使两种同分异构体达到基线分离,但进一步增加水的含量时,洗脱时间会增加,直至洗脱能力不足以让所有的目标物分子全部洗脱出来;填料粒径较小的色谱柱Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)在以95%(v/v)的甲醇-乙腈(2∶8, v/v)-5%(v/v)水做流动相时,等度洗脱15 min, 7种目标物质可以达到基线分离,保留时间随分子极性的减弱依次增加。

图2为该色谱条件下,以7种目标化合物的实测质量数为提取离子的提取离子流图。7-烯胆甾醇和胆固醇是一对同分异构体,理论质量数相同,实测质量数相差只有 0.000 47,在提取离子流图上出双峰,但是可以通过保留时间的不同加以区分。7种目标化合物的实测质量数和保留时间见表1。

图 2 7种目标物质的提取离子流图Fig. 2 Extracted ion chromatograms of the seven target compounds

2.2 质谱条件的选择

APCI源比电喷雾电离源(ESI)更适合中低极性化合物[18],因此采用APCI源作为离子源。分别取7种目标物质的标准溶液,采用流动注射的方式注入质谱的离子源,7种目标物质在正离子模式下产生强响应信号,因此本研究采用正离子模式。在一级质谱分辨率为 70 000 FWHM时,7种目标物质母离子的实测质量数偏差均小于5×10-6,符合定性要求。选择Full MS/dd MS2模式,同时进行一级全扫描和基于母离子列表的数据依赖二级质谱扫描。以一级全扫描的母离子为定量离子,同时二级质谱选择两个碎片离子作为定性离子,用于提高定性的准确性。二级分辨率选择 17 500 FWHM。7种目标物质的质谱参数见表1。

表 1 7种目标物质的质谱参数

* Quantitative ion.

2.3 提取条件的选择

以胎牛血清作为实验对象,在7种目标物质的加标质量浓度分别为胆固醇40 μg/L、角鲨烯 2 000 μg/L、其他5种代谢物(2,4-脱氢胆甾醇、7-烯胆甾醇、豆固醇、菜油固醇、β-谷固醇)200 μg/L 的加标水平下分别考察了不同提取溶剂(5%(v/v)高氯酸、甲醇、甲醇-乙腈(50∶50, v/v)和乙腈)以及不同的血清样品与提取溶剂的体积比(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3)对7种目标物质提取效果的影响。

2.3.1提取溶剂

不同提取溶剂对目标物质的提取效果显示,5%(v/v)高氯酸作为提取溶剂时,提取率不足55% ;甲醇作为提取溶剂时,提取率为73.4% ～86.7%;甲醇-乙腈(50∶50, v/v)作为提取溶剂时,提取率为79.4% ～92.5% ,乙腈作为提取溶剂时,提取率为89.3% ～99.7%(见图3)。溶剂的极性越弱,提取效果越好。综合考虑溶剂极性以及色谱柱适宜溶剂,选择乙腈为提取溶剂。

图 3 不同提取溶剂对7种目标化合物提取率的影响Fig. 3 Effect of different extraction solvents on the extraction ratios of the seven target compounds

2.3.2血清样品与提取溶剂的体积比

不同的血清样品与提取溶剂的体积比(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3)对7种目标物质的提取效果考察结果显示,血清样品与提取溶剂的体积比为1∶1时,提取率为75.4% ～90.1% ;血清样品与提取溶剂的体积比为1∶1.5时,提取率为89.3% ～99.7% ;血清样品与提取溶剂的体积比为1∶2时,提取率为89.3% ～99.7% ;血清样品与提取溶剂的体积比为1∶3时,提取率为89.4% ～99.8% 。随着提取溶剂体积的增加,提取效率基本上呈现先增加后平衡的趋势(见图4),这可能是因为增加提取溶剂的比例,目标物溶出量增加,当提取溶剂的比例进一步增加时,目标物溶出量不再增加,为节约提取溶剂,选择血清样品与提取溶剂的体积比为1∶1.5。

图 4 血清样品与提取溶剂的体积比对7种目标物提取率的影响Fig. 4 Effect of volume ratios of serum and solvent on the extraction ratios of the seven target compounds

表 2 7种目标物质的线性回归方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.4 方法的检出限、定量限和线性范围

将7种目标物质配制成一系列质量浓度的混合标准溶液,在选定的色谱-质谱条件下进样测定,7种目标物质在相应的线性范围内呈现良好的线性关系,线性相关系数(r2)均不小于0.992。使用Q/Orbitrap HRMS,用目标物质的准分子离子精确质量数提取离子流图,无基线噪声,无法采用传统的S/N计算方法测定检出限。因此,本方法将混合标准溶液逐级稀释,得到仪器的检出限(LOD),定量限(LOQ)为检出限的3倍(见表2)。

2.5 加标回收率和精密度

在胎牛血清样品中分别添加低、中、高水平的混合标准溶液(加标质量浓度分别为胆固醇10、20、40 μg/L,角鲨烯500、1 000、2 000 μg/L,其他5种代谢标志物50、100、200 μg/L),进行加标回收和精密度试验,每个浓度平行测定6次。结果(见表3)显示,不同水平的加标回收试验中,各待测物的平均回收率为82.1% ～97.5% ,相对标准偏差为1.6% ～7.4% ,满足方法学要求。

2.6 实际样品的测定

利用本方法对80个血清样品进行检测,胆固醇及其6种代谢标志物均有检出。其中,胆固醇含量最高,在1.31～1.89 g/L 范围内,均在正常值范围以内(医学上规定的成年人正常值为1.12～2.32 g/L),平均值为1.61 g/L,比其他6种代谢标志物高出3个数量级。角鲨烯在0.84～1.86 mg/L 之间,平均值为1.34 mg/L;其余5种代谢标志物按照菜油固醇、7-烯胆甾醇、2,4-脱氢胆甾醇、豆固醇、β-谷固醇的顺序依次降低,但是最高含量均低于1.00 mg/L (见图5)。

图 5 人血清样品中胆固醇及其6种代谢标志物的测定结果(n=80)Fig. 5 Determination results of cholesterol and its six metabolism markers in serum (n=80)

3 结论

利用乙腈超声提取,以配有APCI源的HPLC-Q/Orbitrap HRMS分析,在30 min内可完成血清中胆固醇及其6种代谢标志物的测定。该法具有前处理相对简单,分析时间短,样品基质对目标化合物无干扰,精密度和灵敏度高的优势,且定量结果准确可靠,可以作为血清中胆固醇及其代谢标志物测定的优选方法。