基于UPLC-Q-TOF MS研究煨制 对雷公藤化学成分的影响

刘建群，罗素花，张 锐，舒积成，杨瑞昆，闫 君

(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004)

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)为卫矛科雷公藤属植物[1]，其根可药用，具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血、消肿止痛、杀菌止血之功效[2]，临床上主要用于肾病综合征、类风湿关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病[3-4]。但雷公藤具有肝、肾、心、消化系统和生殖系统等毒性[5]，是近年来毒副作用和不良反应报道最多的中药之一，这严重制约了它的临床应用推广。雷公藤的主要有效成分包括二萜、三萜和生物碱等，多数具有毒性，如雷公藤甲素、雷公藤红素和雷公藤次碱等[6-9]。

古云“有毒宜制”，炮制是降低中药毒性的传统有效方法。有文献报道[10]，从减毒效果来看，雷公藤煨制、米醋蒸制和药汁制可能具有较好的应用前景。其中，烘箱煨制、莱菔子汁炮制和羊血炖能提高雷公藤抗炎效果；蒸制、甘草汁制和双向固体发酵能保持雷公藤抗炎效果；水煮与微波煨制则会降低甚至消除雷公藤抗炎效果。目前，对雷公藤炮制后的化学成分研究较少，仅见对个别成分的分析，而未见对雷公藤化学成分整体、系统的研究。

本课题组[11]研究发现，雷公藤经200 ℃烘箱中煨制后，在减毒、增效以及工艺可控性三方面均有较大优势，值得深入研究。为阐明雷公藤烘箱煨制减毒、增效的物质基础，提高雷公藤临床应用的安全性与有效性，本工作拟采用UPLC-Q-TOF MS技术结合主成分分析(PCA)法和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)法对雷公藤煨制前后的化学成分变化进行系统研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LC-30A液相色谱仪：日本岛津公司产品；AB Sciex Triple TOF 5600质谱仪：美国AB Sciex公司产品；Agilent 1260 高效液相色谱仪：美国Agilent公司产品；GZX-9140 MBF数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司产品；PS-40洁康超声仪：东莞市洁康超声波设备有限公司产品；BT25S型十万分之一电子天平：德国Sartorius公司产品；Milli-Q超纯水制备仪：美国Millipore公司产品。

甲醇：色谱纯，迪马公司产品；甲酸：色谱纯，阿拉丁公司产品；乙腈：色谱纯，ACS公司产品；实验用水为Milli-Q超纯水；氯化钠、乙醇、盐酸、氨水、乙醚：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品。雷公藤根药材：采自江西萍乡市，经刘建群教授鉴定为卫矛科雷公藤属植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)。雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、雷酚内酯、去甲泽拉木醛、雷公藤内酯甲、雷公藤红素对照品：含量均大于98%，郑州丰耀农业科技有限公司产品；南蛇藤肉桂酰胺碱、tripfordine A、雷酚新内酯苷、雷公藤定碱、1-羟基-2,5,8-三甲基-9-芴酮、25(9→8),26(13→14)Abeo-24-nor-8,14-seco-friedelan-2,3-dihydroxy-1,3,5(10),6,8-pentaen-29(13)-olide对照品：由本实验室分离制得，经HPLC检测，纯度均大于98%。

1.2 供试品溶液的制备

1.2.1雷公藤药材及其煨制品溶液的制备

分别称取2份各10 g药材，作为生品和煨制品组。煨制品按以下方法制备：取晒干后的黄土过4号筛，按每4 g黄土中加入1 mL 10%食盐水的比例混匀得到黄泥，用锡箔纸包住药材，再用黄泥均匀包裹，晾干后置于200 ℃烘箱中煨制45 min，剥离黄泥即得。将生品和煨制品粉碎，用100 mL甲醇超声提取30 min，取1 mL上清液，过0.22 μm有机滤膜，得生品和煨制品溶液，采用同样的方法制备平行样品溶液各10份。

1.2.2雷公藤总生物碱及其煨制品溶液的制备 称取40 g雷公藤药材，加入700 mL 95%乙醇，超声提取30 min，过滤，将滤液减压蒸干。向残渣中加入300 mL 1%盐酸溶液溶解，过滤，向滤液中加10 mL浓氨水调节pH 9，用400 mL乙醚萃取，挥干乙醚液，得到总生物碱。精密称取12 mg总生物碱2份，其中1份用10 mL甲醇溶解，过0.22 μm滤膜，得总生物碱溶液；另一份按照 1.2.1节方法煨制后，制得总生物碱煨制品溶液。

1.2.3雷公藤次碱、雷公藤红素及其煨制品溶液的制备 称取约14 mg雷公藤次碱和雷公藤红素对照品各2份，其中1份用10 mL甲醇溶解，过0.22 μm滤膜，得雷公藤次碱和雷公藤红素溶液；另一份按照1.2.1节方法煨制后，用同样的方法制得雷公藤次碱和雷公藤红素煨制品溶液。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：Thermo C18柱(100 mm×2.1 mm×2.2 μm)；流动相：A为0.1%甲酸-水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～30 min(5%～60%B)，30～52 min(60%B)，52～57 min(60%～100%B)，57～60 min(100%B)；60～60.1 min(100%～5%B)，60.1～63 min(5%B)；流速0.3 mL/min；进样量5 μL；柱温30 ℃。

1.3.2质谱条件 离子源喷雾电压5 500 V；离子源温度600 ℃；裂解电压100 V；碰撞能量55 eV，碰撞能量扩展为20 eV；雾化气为N2；辅助气压力：GS1，GS2均为0.41 MPa，气帘气(CUR)压力0.24 MPa；母离子扫描范围m/z100～1 000。

1.4 样品测定及数据分析

取制备好的雷公藤药材及其煨制品溶液各10份，进行UPLC-Q-TOF MS分析。得到的质谱数据经Marker View软件处理后，将数据导入SIMCA-P 14.1统计软件，进行PCA和OPLS-DA分析。以同样的方法将制备好的总生物碱、雷公藤次碱、雷公藤红素及其煨制品、混合对照品溶液进行分析。

2 结果与讨论

2.1 UPLC-Q-TOF MS图谱分析

正离子模式下，雷公藤药材、总生物碱、雷公藤次碱、雷公藤红素及各自煨制品的基峰强度离子流图(BPI)示于图1。对比可知，煨制后各成分发生了显著变化。煨制后，雷公藤次碱(26.176 min)的色谱峰面积减小；雷公藤红素(35.273 min)的色谱峰消失，结合MS分析发现，产生了多个降解(27.145，32.550，34.330 min等)和重排化合物(36.315，40.209，41.587 min等)。对比雷公藤药材、总生物碱、雷公藤红素煨制前后的BPI图，发现雷公藤药材煨制后，保留时间为6.566、8.655、12.117、25.119、34.334 min等的色谱峰消失；保留时间为25.720、26.591 min等的色谱峰面积增加；保留时间为35.587、35.859 min等是新产生的色谱峰。通过与总生物碱和雷公藤红素BPI图比较，推测6.566、8.655 min峰为生物碱类成分，34.334 min为雷公藤红素。雷公藤总碱煨制后，保留时间在4～10 min、20～25 min的多个色谱峰消失。

图1 雷公藤药材生品(a)及其煨制品(b)，雷公藤总生物碱(c)及其煨制品(d)， 雷公藤次碱(e)及其煨制品(f)，雷公藤红素(g)及其煨制品(h)的BPI图Fig.1 BPI of untreated (a, c, e, g) and processed (b, d, f, h) Tripterygium wilfordii, total alkaloid, wilforine and celastrol

2.2 PCA分析

雷公藤药材生品及其煨制品的UPLC-Q-TOF MS数据PCA分析得分图示于图2。每个点代表1个样品，横、纵坐标分别为第一、第二主成分得分。可以看出，雷公藤生品及其煨制品在第一主成分得分上分别聚向横轴的相反方向，表明二者的UPLC-Q-TOF MS数据差异特征明显。

图2 雷公藤生品(a)和煨制品(b)的PCA得分图Fig.2 Score plots of PCA for untreated (a) and processed (b) Tripterygium wilfordii

图3 雷公藤生品和煨制品的 OPLS-DA差异成分的S-plot曲线Fig.3 S-plot curve of OPLS-DA for untreated and processed Tripterygium wilfordii

2.3 OPLS-DA分析

雷公藤生品及其煨制品的UPLC-Q-TOF MS数据OPLS-DA分析的S-plot图示于图3。S-plot图中每个点代表1个变量，即位于某保留时间的某质荷比信号。横坐标代表变量的贡献度(协方差)，纵坐标代表变量的相关性(可信度)，在-1～1之间取值。雷公藤生品及其煨制品之间差异显著的分子离子峰分布于S曲线的两端，S曲线的右上角代表雷公藤煨制后含量升高的化合物的分子离子峰，S曲线的左下角代表雷公藤煨制后含量降低的化合物的分子离子峰，越靠近S曲线两端的点，所代表的分子离子峰对两组样品间的差异贡献越大。

通过分析OPLS-DA模型，并结合雷公藤生品煨制前后的BPI谱图，共发现81种化学成分的含量具有显著性差异。

2.4 雷公藤生品及其煨制品差异性成分鉴定

根据化合物质谱裂解规律，结合文献及对照品对照对煨制前后的81种差异成分进行结构解析，鉴定出其中35种化合物[12-30]，列于表1，并推测了其余48种成分的结构类型及来源。鉴定的35种化合物中，包含27种生物碱和5种三萜，煨制后有26种成分含量降低，7种成分含量升高，2种为新生成的化合物。将鉴定的每种化学成分在雷公藤生品与煨制品中峰面积的比值作为量化指标，能够反映出35种差异性化学成分的量变趋势及幅度。煨制前后峰面积差异较大的代表性化合物包括雷公藤红素、南蛇藤糠酰胺碱和1-去乙酰基雷公藤定碱，其可能的二级质谱裂解途径示于图4。其余48种成分中，含有29种生物碱，5种三萜；煨制后25种成分含量下降，21种成分含量增加，推测煨制后17种成分来源于生物碱，4种成分来源于雷公藤红素。综上，煨制后含量显著变化的成分大部分为生物碱，占69%；其次为三萜，占12%。由此推测，生物碱和雷公藤红素的变化可能是雷公藤煨制减毒增效的物质基础。

3 结论

采用UPLC-Q-TOF MS结合PCA法、OPLS-DA法系统研究了煨制对雷公藤化学成分的影响，发现雷公藤煨制后有81种化学成分含量变化显著，鉴定了其中35种成分，这些化合物绝大部分为生物碱，其次为三萜(含雷公藤红素)。由于生物碱和雷公藤红素均为雷公藤抗炎的有效成分，且毒性较大，因此，生物碱和雷公藤红素的变化可能是雷公藤煨制减毒增效的物质基础。该研究可为研发新的抗类风湿性关节炎的先导化合物提供参考。

表1 UPLC-Q-TOF MS鉴定的35种雷公藤煨制前后的显著性差异化合物Table 1 35 significant difference constituents in untreated and processed Tripterygium wilfordii based on UPLC-Q-TOF MS

续表1

注：↓表示煨制后化合物含量降低；↑表示煨制后化合物含量升高

图4 雷公藤红素(a)、南蛇藤糠酰胺碱(b)和1-去乙酰基雷公藤定碱(c)的二级质谱裂解途径Fig.4 MS/MS fragmentation pathways of celastrol (a), celafurine (b) and 1-desacetylwilfordine (c)