外源GA3影响牡丹花芽DNA甲基化水平和相关酶基因的表达分析

张涛，司福会，张玉喜，盖树鹏



外源GA3影响牡丹花芽DNA甲基化水平和相关酶基因的表达分析

张涛，司福会，张玉喜，盖树鹏

（青岛农业大学生命科学学院/山东省高校植物生物技术重点实验室，山东青岛 266109）

【目的】外施赤霉素（GA）是生产上辅助解除牡丹花芽休眠进行反季节盆花生产的常用手段，赤霉素如何发挥作用解除牡丹花芽休眠是未解的科学问题，本文旨在明确赤霉素是否通过表观遗传方式参与内休眠调控。【方法】从DNA甲基化入手，以4年生‘鲁菏红’为材料，500 mg·L-1的GA3处理花芽，并在处理后0.5、1、3和5 d后取健壮顶芽，CTAB法提取花芽DNA，HPLC技术测定GA3处理后牡丹花芽DNA甲基化水平的变化；利用转录组分析结合RACE技术得到牡丹3种DNA甲基转移酶基因、、和DNA去甲基化酶基因的序列，生物信息学方法比对基因序列并分析可能的结构域，MEGA 5.0构建系统发育树；以为内参，利用qPCR方法分析其组织表达特性和对GA3的响应。【结果】3种DNA甲基转移酶基因（）的开放阅读框长短不一，、、开放阅读框长度分别为1 118、1 056、2 175 bp，编码的氨基酸数目分别为372、351、724。3种DNA甲基转移酶均有甲基转移酶结构域。而DNA去甲基化酶基因的序列较长，开放阅读框为6 636 bp，编码2 211个氨基酸。上存在保守的DNA糖基化结构域。系统发育分析表明，牡丹中的PsCMT和PsDRM蛋白与葡萄的VvCMT2蛋白亲缘关系最近，PsMET和PsROS1与大部分木本植物聚为一支，与烟草等距离较远。、、在牡丹初花期的各个组织（根、茎、叶、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮）中均有表达，其中在牡丹根中表达量较高，而在心皮中表达量最高。GA3处理5 d，牡丹花芽迅速萌动，60 d时萌动率为97.5%，成花率为92.5%；对照20 d时才有少量花芽萌动，至60 d时萌动率仅为23.1%。GA3显著降低了牡丹花芽DNA甲基化水平（＜0.01），从处理前的38.9%降至处理5 d时的28.7%；GA3处理提高了和的表达水平，降低了的表达水平，而的表达水平差异不显著。【结论】GA3处理通过诱导表达、抑制表达导致了DNA低甲基化，进而促进了牡丹休眠解除，可能是赤霉素发挥作用的一种重要方式。

牡丹；DNA甲基转移酶；；赤霉素；DNA甲基化；休眠解除

0 引言

【研究意义】牡丹（Andr.）是中国著名的传统观赏花卉之一，同其他多年生木本植物一样，其在自然条件下必须经过冬天一段时间低温，才能解除休眠来年正常开花。足够低温累积是解除休眠的有效措施。低温解除牡丹休眠进程中，甲基化水平是下降的[1]，暗示表观遗传修饰在其中发挥了重要作用。生产上，常用赤霉素辅助解除休眠，进行反季节花期调控生产。因此，明确赤霉素解除休眠是否与甲基化调控有关对于牡丹反季节生产具有重要意义。【前人研究进展】真核生物中，DNA胞嘧啶的甲基化与基因表达密切相关[2]，5-胞嘧啶的甲基化是最普遍的DNA修饰。胞嘧啶甲基化在多种生物发育过程中发挥关键作用，包括基因沉默、转座子的失活和印记基因表达[3-4]。DNA甲基转移酶（Dnmt）家族是植物进行甲基化修饰的工具，它能催化S-adenosylmethionine（SAM）上的甲基转移到胞嘧啶嘧啶环的C-5位点，在表观遗传基因调控中起中心作用[5]。植物中的DNA甲基转移酶主要包括甲基转移酶、染色质甲基转移酶、结构域重排甲基转移酶这3类[6]。拟南芥中，主要维持重复序列和单拷贝DNA序列中CpG位点的DNA甲基化[7]。能维持重复和单拷贝DNA序列中CG类型的甲基化，并影响其形态特征[8]，是植物中特有的一类甲基化酶，可以在异染色质发生DNA甲基化，其功能主要是维持CHG位点的DNA甲基化[2,9]。另外，植物DNA去甲基化酶（repressor of silencing 1）是一种DNA糖基化酶，它可以去除DNA5-甲基胞嘧啶上的甲基而发动DNA的去甲基化过程。目前，其功能和特性仅在拟南芥中进行了较为详细的研究[10]。【本研究切入点】关于赤霉素对甲基化影响的报道大都集中在模式植物上，在木本植物牡丹中的研究未见报道。【拟解决的关键问题】探究赤霉素促进休眠解除与DNA甲基化变化的潜在联系，为进一步研究赤霉素解除休眠的机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为4年生‘鲁菏红’（‘Luhehong’）健壮植株，由菏泽牡丹研究所提供。2016年10月下旬定植于盆中，11月12日移入温室，用500 mg·L-1的GA3处理花芽（棉花缠绕花芽，滴加GA3溶液1 mL），并在处理后0.5、1、3和5 d后取健壮顶芽，每组设3个重复，清水为对照；每处理15株，共90株，剥去鳞片后，液氮速冻后于-80℃保存备用。另取上述处理60株，移入温室后60 d调查植株生长情况。取初花期（大风铃期）牡丹花芽的各个组织（根、茎、叶、花瓣、萼片、苞片、雄蕊、心皮），每组取3个重复，用于组织表达分析。

1.2 总RNA提取与cDNA合成

采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa，大连）提取总RNA，-80℃保存。cDNA的合成按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒（TaKaRa，大连）说明书进行。RACE- Ready-cDNA第一链合成按照SMARTer® RACE 5′/3′ Kit说明书进行。

1.3 RACE扩增和实时定量PCR

根据已知序列设计特异性引物进行RACE扩增。

反应条件：94℃ 30 s，72℃ 3 min，共5个循环；94℃ 30 s，70℃30 s，72℃3 min，共5个循环；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，共25个循环。

将反转录得到的cDNA稀释3倍作为实时定量PCR反应的模板，设定3个技术重复。为内参，引物见表1，数据分析采用2-ΔΔCT法。Real-time PCR反应体系为20 μL，包括ddH2O 6.8 μL，SYBR Premix DimerEraser（2×）10.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol·L-1）0.6 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol·L-1）0.6 μL，cDNA 2.0 μL。反应在Light Cycler 480 real-time PCR System上进行，反应条件参考司福会等[11]。

表1 引物相关信息

1.4 生物信息学分析

测序结果利用DNAMAN6.0进行分析和拼接，利用Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行蛋白质Blast对比并分析结构域。利用IBS 1.0.2绘制蛋白质结构域分布图。系统发育树采用MEGA 5.0中的邻接法（neighbor-joining，NJ）构建，置信度检验设置为Bootstrap=1 000。

1.5 甲基化水平的测定

利用CTAB法提取植物总DNA[12]，100℃加热2 min使约5 μg DNA变性，迅速置于冰上。甲基化测定用Hasbun等的方法[13]，变性的DNA在37℃经核酸酶P1（Sigma）和碱性磷酸酶（Sigma）处理后，15 000×离心20 min，上清液经0.025 μm滤纸（Millipore，Bedford，MA）过滤，上样Eclipse XDB-C18柱（5 μm，150×4.6 nm，Aglient）用于HPLC分析（Aglient 1100 Series），流动相为KH2PO3/ methanol（98﹕2，v/v），约20 min。标样胞嘧啶（C）和甲基胞嘧啶（mC）购自Sigma。使用下列公式计算甲基胞嘧啶百分比：mC（%）=（mC/（C+mC））×100。

2 结果

2.1 赤霉素处理解除牡丹花芽休眠的效应

GA3处理后，牡丹花芽迅速萌动，处理5 d时，大部分花芽即已萌动；至60 d时调查，萌动率为97.5%，成花率为92.5%。对照萌动较晚，20 d时才有少量花芽萌动，至60 d时萌动率仅为23.1%，未见花朵开放，仅有5.1%的成花率（图1）。可见，赤霉素处理可在一定程度上代替低温，促进休眠解除，显著提高萌动率和成花率。

2.2 赤霉素对甲基化水平的影响

利用HPLC分析了GA3处理后牡丹花芽的甲基化水平。由图2可以看出，GA3处理显著降低了花芽的甲基化水平，且随着施加GA3天数的增加，花芽甲基化水平呈下降趋势。从38.9%降至处理5 d时的28.7%，而对照甲基化水平维持在37.5%—41.5%，相对稳定。

A：对照 Control；B：500 mg·L-1 GA3处理 Treated with 500 mg·L-1 GA3

*P＜0.05；** P＜0.01。图6同 The same as Fig. 6

2.3 甲基化相关酶基因的克隆

根据DNA甲基化相关酶基因保守序列，从转录组数据库中筛选出相关片段[12]，其中（Accession number：MH038045）和（Accession number：MH087469）已包含完整的ORF，而（ID：JI448809）和（ID：JI448935）编码序列不完整，进行了RACE扩增。根据目的基因的序列设计了特异性引物（表1），经过RACE PCR扩增，得到了997 bp的5′ RACE PCR产物和1 245 bp的5′ RACE PCR产物（图3）。测序后利用DNAMAN与已知cDNA进行序列拼接，最终获得1 506 bp的cDNA序列（Accession number：MH038046）、1 582 bp的cDNA序列（Accession number：MH038044）。开放阅读框的长度为1 118 bp，编码的氨基酸数目为372，蛋白质分子量为41.469 kD。开放阅读框的长度为1 056 bp，编码351个氨基酸，蛋白质分子量为39.853 kD。开放阅读框的长度为2 175 bp，编码724个氨基酸，蛋白质分子量为81.477 kD。含有6 636 bp的开放阅读框，编码2 211个氨基酸，分子量为246.675 kD。

在线分析牡丹和的序列表明，在152—269 aa间含有一个BAH结构域（The Bromo-adjacent homology domain），在311—375 aa间存在Cyt_C5_DNA_methylase结构域；在22—351 aa间存在一个SAM-dependent MTase C5-type结构域；在序列上找到两个结构域，一个是位于232—276 aa间的UBA（Ubiquitin-associated domain）结构域，另一个是在393—723 aa的SAM-dependent MTase DRM-type结构域；上存在DNA糖基化结构域、HhH-GPD 结构域、Perm-CXXC结构域和RRM-DME结构域（图3）。

为了解牡丹PsDRM、PsMET、PsCMT、PsROS1蛋白与其他植物相应基因的进化关系，对牡丹中4种DNA甲基化相关酶进行系统发育分析（图4）。结果表明，PsCMT和PsDRM与葡萄的VvCMT2亲缘关系最近，与模式植物拟南芥亲缘关系较远；PsMET和PsROS1与大部分木本植物聚为一支，比如胡杨，与烟草等距离较远。

图3 DNA甲基化酶（A）和去甲基化酶（B）的结构域

图4 牡丹甲基化相关酶的系统发育分析

2.4 牡丹甲基化相关酶基因的组织表达特性

在牡丹的初花期（大风铃期）取各个组织（根、茎、叶、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮），利用荧光定量PCR对DNA甲基化酶基因的表达模式进行了分析。结果表明，、、在各个组织中均能检测到表达，但表达量不同。和在根、茎、雄蕊和苞片中表达量相对较高，在叶片和心皮中较低；而在根中的表达量最高，在心皮中的表达量相对较高，其次为茎和萼片，在雄蕊中最低；在心皮中表达量最高，其次是萼片，在叶片和花瓣中表达较少（图5）。

2.5 赤霉素对甲基化相关酶基因表达的影响

植物中的甲基化水平是由甲基化酶和去甲基化酶共同维持的[14]。因此，对相关酶基因进行荧光定量PCR分析（图6）。结果表明，GA3处理的牡丹花芽与对照相比表达量差异不显著（＞0.05）。用GA3处理后，的表达量在0.5 d内就有了大幅度的提高，这表明GA3显著地提高了的表达水平，可快速响应GA3。GA3处理0.5—3 d，的表达明显减弱。与此相反，经GA3处理后，去甲基化酶表达量显著提高，且有逐渐增加的趋势。

3 讨论

DNA胞嘧啶甲基化、组蛋白修饰和RNA干扰（RNAi）是最常见的分子表观遗传学机制，在基因调控中发挥重要作用[14]。DNA胞嘧啶甲基化大约占总胞嘧啶的30%[15]，越来越受到人们的重视。DNA甲基化水平主要是由DNA甲基转移酶和去甲基化酶创建和维持的。相关基因克隆和功能分析主要见于模式植物，但木本植物中相关基因克隆的报道较少。本研究从牡丹花芽中克隆了DNA甲基化酶基因、、和DNA去甲基化酶，序列分析表明具有相应保守结构域，并在不同组织中检测到了它们的表达，暗示它们可能参与了牡丹细胞中DNA甲基化的调控。

1：根root；2：茎stem；3：叶Leaf；4：萼片sepal；5：苞片bract；6：花瓣petal；7：雄蕊stamen；8：心皮carpel

图6 GA3处理后甲基化相关酶基因的表达水平

赤霉素是一种重要的植物激素，参与调控多种生长和发育过程[16]。目前已对赤霉素的生物合成和代谢途径有了比较明确的了解[17]。然而，赤霉素在表观遗传调控中发挥怎样的作用仍未可知。李梅兰等[18]研究表明，在春化诱导不结球白菜开花期间，DNA甲基化水平降低与芽尖分生组织中内源GA含量增加存在间接关系。本研究表明，赤霉素导致牡丹的甲基化水平下降。已有研究表明，休眠解除进程中伴随着DNA低甲基化[1,19]。因此，赤霉素处理导致DNA低甲基化，可能是其发挥作用促进休眠解除的一种重要方式。

另外，赤霉素处理可能通过调节DNA甲基化相关酶基因的表达而影响甲基化水平。从小麦幼苗和发芽胚的细胞核中纯化的DNMT的活性受到GA3抑制，但GA3添加到小麦胚的核提取物中似乎刺激了DNA甲基化酶活性[20]。然而，在水稻中，外施GA3不会引起表达的显著变化[21]。近期在烟草中的试验表明，和响应GA3信号表达水平下降[14]。显示了不同生物中的（、和）对GA响应是有差异的[19-23]。ROS1介导的主动去甲基化可以导致内外源基因的转录沉默[24]，引起5S rDNA染色质的解聚及植物对生物胁迫和环境胁迫的响应[25-27]。本研究中，GA3处理导致的表达量提高。CMT主要功能是维持CG位点甲基化，GA3处理促进了细胞分裂，需要CMT大量表达维持甲基化水平。DRM可导致CHG位点重头甲基化，GA3处理后表达受到抑制，而表达量显著提高，二者联合作用，导致总体甲基化水平的下降。

4 结论

利用转录组分析和RACE技术，得到了牡丹DNA甲基转移酶基因（、和）和DNA去甲基化酶基因，具有相应保守结构域。外施GA3显著降低DNA甲基化水平，导致DNA低甲基化，进而促进了休眠解除，是赤霉素发挥作用的一种方式。DNA甲基化水平的降低可能与赤霉素诱导表达水平下降和表达量提高有关。

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（责任编辑 岳梅）

Effect of Exogenous Gibberellin on DNA Methylation Level and Expression of Related Enzyme Genes in Tree Peony Floral Buds

ZHANG Tao, SI FuHui, ZHANG YuXi, GAI ShuPeng

(College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University/Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province, Qingdao 266109, Shandong)

【Objective】 Application of exogenous gibberellin (GA) is a commonly method to break floral bud dormancy in the anti-season production of tree peony. However, the mechanism of how gibberellin plays a role in breaking dormancy of tree peony is an unsolved problem. The objective of this study is to clarify whether GA participates in dormancy regulation through epigenetic mode. 【Method】 In this study, 4-year-old ‘Luhehong’ was used as material, and 500 mg·L-1exogenous GA3was applied. Terminal buds were harvested and DNA was extracted at 0.5, 1, 3 and 5 d after GA3applied. The DNA of peony floral buds was extracted using CTAB method and DNA methylation level of floral buds was analyzed by HPLC technology. Three types of DNA methyltransferase genes,,and, and one DNA demethylase genewere obtained using RACE amplification based on transcriptome analysis. Bioinformatics method was performed to analyze gene sequences and possible domains, and MEGA 5.0 was used to construct phylogenetic tree. Usingas reference gene, the tissue expression characteristics and response to GA3of these genes were analyzed by qPCR method. 【Result】The open reading frame (orf) of the three DNA methyltransferases (Dnmts) varies in length. The orf lengthof,andis 1 118, 1 056 and 2 175 bp, respectively. The number of amino acids encoded is 372, 351 and 724, respectively. All three DNA methyltransferases have methyltransferase domains. The DNA demethylase genehas a long sequence with an ORF of 6 636 bp and encodes 2 211 amino acids, and there is a conserved DNA glycosylation domain in. Phylogenetic analysis indicated that the PsCMT and PsDRM proteins in peony were closely related to the VvCMT2 protein of grape, PsMET and PsROS1 were grouped with most woody plants and located far away from tobacco.,andwere expressed in all tissues (roots, stems, leaves, bracts, sepals, petals, stamens, carpels) at the early flowering stage of peony, and the expression level of,andwas higher in the root of peony than that of other tissues, while the expression level ofwas the highest in carpels. Application of GA3dramatically accelerated buds sprouting and flowering. Bud sprouting could be observed 5 d after GA3application, and the germinating rate of bud was 97.5% with a 92.5% flowering rate after 60 d of GA3application. But in the control group, only a few buds germinated at 20 d, and the germinating rate was only 23.1% at 60 d. GA3significantly decreased the DNA methylation level of peony bud (＜0.01), from 38.9% before treatment to 28.7% at 5 d after treatment. GA3treatment increased the expression ofand, decreased the expression level of, but there was no significant difference inexpression. 【Conclusion】GA3treatment inducesexpression and inhibitsexpression, which leads to DNA hypomethylation and thus promotes dormancy release of peony, which may be an important way for gibberellin to play its role.

; DNA methyltransferase;; gibberellin; DNA methylation; dormancy release

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.18.012

2018-04-16；

2018-06-19

国家自然科学基金面上项目（31372104，31672194）

张涛，E-mail：zhang1995tao@163.com。通信作者盖树鹏，E-mail：spgai@qau.edu.cn