黄淮海夏玉米区玉米籽粒带菌检测分析

金柳艳，郭宁，石洁，张海剑，刘树森，张家齐



黄淮海夏玉米区玉米籽粒带菌检测分析

金柳艳，郭宁，石洁，张海剑，刘树森，张家齐

（河北省农林科学院植物保护研究所，河北保定 071000）

【目的】明确黄淮海夏玉米区玉米籽粒带菌量,为玉米安全生产、储藏加工以及检疫提供参考依据。【方法】分别于玉米乳熟期及完熟期，采集黄淮海夏玉米区4个省（河北、河南、山东、安徽）90个市/县的玉米果穗，每个市/县采集表面未发生病症且果穗饱满的玉米穗4个，共采集720个样本。对所有样本进行籽粒外部及内部带菌量及带菌种类的检测，外部检测采用洗涤检测法，通过统计菌落总数与稀释倍数，计算籽粒表面的孢子负荷量及分离到的各菌属的分离比例；内部检测采用PDA平板法，对籽粒外部检测过的10个籽粒消毒后置于PDA平板上进行培养，统计每个籽粒带菌情况，计算籽粒带菌率及各菌属的分离频率。并且对籽粒内部分离频率较大的菌群进行形态学和分子鉴定。【结果】供试样本带菌量较大，乳熟期籽粒孢子负荷量在0—1 886个/粒，均值为439个/粒，籽粒带菌率在0—65.0%，均值为23.6%；完熟期籽粒孢子负荷量在18—2 658个/粒，均值为942个/粒，籽粒带菌率在10.0%—100.0%，均值为59.6%。完熟期带菌量大于乳熟期，但部分地区乳熟期带菌量仍较大。不同地区玉米籽粒带菌量存在差异，河南省的玉米籽粒带菌量较大，安徽省带菌量最少，河北省与山东省居中且差异不明显。玉米籽粒内部以及外部均携带的真菌类群有镰孢菌（spp.）、青霉菌（spp.）、曲霉菌（spp.）、链格孢菌（spp.）、木霉菌（spp.）、根霉菌（spp.）、蠕孢菌（-spp.）、毛霉菌（spp.）。乳熟期籽粒外部和内部镰孢菌的分离比例分别为59.1%和36.1%，说明玉米在乳熟期时即有大量镰孢菌侵入；籽粒外部青霉菌和曲霉菌的分离比例分别为8.9%与0.7%，籽粒内部的分离频率分别为6.0%与1.9%，说明乳熟期青霉菌与曲霉菌也已经开始侵染玉米果穗。完熟期籽粒外部与内部镰孢菌的分离比例分别为71.9%和58.5%，籽粒外部青霉菌和曲霉菌的分离比例分别为17.0%和0.9%，籽粒内部分离频率分别为9.3%和2.6%，说明镰孢菌、青霉菌、曲霉菌为本研究黄淮海夏玉米区玉米籽粒携带的主要真菌。形态与分子鉴定结果显示，镰孢菌属中轮枝镰孢（）的分离频率为29.7%，层出镰孢（）的分离频率为25.9%，禾谷镰孢（）的分离频率为1.3%，表明轮枝镰孢为优势菌；青霉菌主要分离到绳状青霉（）和草酸青霉（），分离频率分别为5.0%和3.6%；曲霉菌主要为黄曲霉（）和黑曲霉（），分离频率分别为1.4%和1.2%。【结论】表面无症状的玉米籽粒在乳熟期及完熟期均携带大量病原菌，且完熟期带菌量大于乳熟期；镰孢菌在黄淮海夏玉米区的分离频率最大，轮枝镰孢为当地玉米籽粒携带的优势真菌。

玉米籽粒；真菌检测；分离频率；黄淮海夏玉米区

0 引言

【研究意义】玉米是我国重要的粮食作物、饲料来源及轻工业加工原料，在国民经济及农业生产中占有重要地位。玉米果穗在田间生长过程中会遭遇病原真菌的侵染，造成部分果穗发生穗腐病，表现为籽粒、穗轴或整个果穗霉变，使发病籽粒携带大量病原菌[1-4]。发病籽粒收获后，由于含水量较高或贮藏不当等原因，容易造成周围籽粒腐烂，导致玉米品质劣变[5-6]。不仅如此，病原真菌在生长代谢过程中还会产生伏马毒素、黄曲霉毒素等多种霉菌毒素，造成食用者中毒[7]。而且玉米籽粒作为主要的饲料来源，真菌污染导致饲料适口性及营养价值降低，牲畜中毒或死亡，也会造成水产品、乳及乳制品、肉类等农副产品连锁性污染[8-12]，据美国食品和药物管理局的调查表明，全球25%的饲料及饲料原料受到真菌毒素的污染[13]。有些果穗或籽粒表面无明显病害症状，但这并不代表其不携带病菌。由于玉米的营养物质较为丰富，同时其胚芽大、吸湿性较强，若晾晒不彻底或贮藏环境湿度较大，当温度合适时，也可能会引起籽粒表面或内部潜藏真菌快速、大量繁殖，引起周围籽粒发生霉变。因此，检测玉米籽粒带菌量及病菌种类并提出预防措施，对玉米安全生产具有重要意义。【前人研究进展】真菌毒素是产毒真菌的次级代谢产物，许多研究将关注点放在真菌毒素，从而忽视了对真菌的研究，真菌与真菌毒素并非一一对应，一种真菌可产生多种真菌毒素，一种毒素也可能由多种真菌产生，因此不能从毒素推测真菌种类。真菌侵染不仅发生在玉米的开花、结果、成熟、收获过程中，也发生在玉米籽粒晾晒、收购、加工、贮藏、运输等过程[14]。国内外对完熟期与贮藏期玉米籽粒带菌检测的研究较多，对收获前期籽粒带菌检测的研究较少。Mannaa等[15-16]对收获前后有害真菌和真菌毒素的危害以及控制策略进行了综述，并对收获前期、收获时、贮藏期真菌群落的种类进行了统计分析，发现玉米籽粒在不同阶段携带真菌群落种类以及数量会发生改变；Lacey[17]研究发现，玉米果穗于吐丝期开始就会受到真菌感染，乳熟期以后若虫害发生会加重感染，且收获前和收获后镰孢菌与黄曲霉对玉米果穗危害较大。许多研究表明，镰孢菌（spp.）为玉米穗腐病的主要致病菌，同时也是玉米种子或籽粒携带的优势菌群[18-22]。Marco等[7]对墨西哥27个贮藏期玉米样本进行带菌检测，发现镰孢菌的分离比例较大，为32%；曲晓丽等[18]对从农户收集的88份玉米籽粒进行带菌检测，发现镰孢菌为优势菌属，同时青霉菌（spp.）、曲霉菌（spp.）、黑孢菌（spp.）、木霉菌（spp.）的分离频率亦较高；郭聪聪等[19]采集2011—2012年间甘肃省5个地区的225 份玉米籽粒样本进行了镰孢菌的分离、鉴定，共分离出516株镰孢菌，其中轮枝镰孢（）为优势病原菌。我国对玉米种子带菌检测的研究较多，马奇样等[23]对500粒种子洗涤检查发现，寄藏于种子的真菌孢子数量大，分布普遍；罗晓杨等[20]采用平板培养法、冷冻滤纸法对24份玉米生产品种进行了种子带菌检测，结果表明玉米种子主要携带镰孢菌，其次为曲霉菌和青霉菌。【本研究切入点】玉米在生长过程中果穗会遭遇大量病原菌的侵染而发生穗腐病，但是未出现病症的籽粒表面及内部携带病原菌的种类以及数量还未见报道。迄今为止，我国对农作物真菌污染的研究主要是取作物收获后或贮藏期的籽粒作为样本，缺少对于收获前真菌检测的研究，且取样并非表面完全无病症的籽粒。【拟解决的关键问题】对黄淮海夏玉米区乳熟期及完熟期的表面无病症籽粒进行带菌检测，明确玉米籽粒在不同熟期的带菌情况，为玉米安全生产、贮藏、加工与检疫提供依据与参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为笔者实验室2017年采集的黄淮海夏玉米区玉米穗样本，分别于玉米乳熟期、完熟期在河北省（29个）、河南省（26个）、山东省（27个）、安徽省（8个）4个省共90个市/县进行采样。品种为郑单958，每个地区选择无明显病虫害发生的地块，每个地块去除4行边行，中间区域每隔10 m采集1个未发生病虫害、果穗饱满的玉米穗，每个地区分别于乳熟期和完熟期各取4个果穗，共计720个果穗样本。具体采样时间见表1。

表1 采样地区与时间

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集与保存 取样时连同苞叶一起取下，用灭菌后的吸水纸包裹严实，乳熟期果穗由于含水量较高，取下后置于装有冰袋的泡沫盒内，以便运输途中保存。成熟期果穗含水量较低，直接用灭菌后的吸水纸包好后置于泡沫盒中保存运输。

1.2.2 籽粒外部带菌种类及带菌量检测 带菌检测时需要对每个市/县采集的乳熟期与完熟期的各4个果穗进行检测，将每个玉米穗全部脱粒，籽粒充分混匀后从中随机取10粒置于50 mL离心管中，加入10 mL灭菌水，用斡旋振荡器充分振荡10 min，2 000 r/min 离心10 min，倒去上清液，加5 mL无菌水均匀悬浮后取出适当体积用无菌水进行系列梯度稀释，稀释梯度分别为10、50、100倍，每个稀释梯度菌悬液吸取100 μL均匀涂抹到直径9 cm的PDA平板上（PDA中加适量乳酸抑制细菌），20℃恒温箱中黑暗条件下培养观察，5 d后观察平板上的菌落，根据菌落的培养性状和形态特征，参考文献[24-25]对孢子进行识别与鉴定，根据菌落总数和稀释倍数计算孢子负荷量以及各菌属的分离比例。

孢子负荷量（个/粒）=菌落总数×稀释倍数/10粒

某类菌分离比例（%）=（某类真菌菌落个数/菌落总数）×100

1.2.3 籽粒内部带菌种类及带菌量检测 籽粒内部带菌检测采用美国国家种子健康体系（national seed health system，NSHS）建议的PDA平板法[26]，每个玉米穗检测10粒。将籽粒外部检测时的10个玉米籽粒置于2%的次氯酸钠溶液中消毒10 min，用无菌水冲洗3次，置于灭菌滤纸上，于超净台中吹干表面游离水；然后将籽粒均匀摆放在直径为9 cm的PDA平板上，每皿10粒；26℃恒温箱中12 h光照/12 h黑暗培养，5 d后镜检，计算籽粒带菌率以及分离到的各菌属的分离频率。

籽粒带菌率（%）=（带菌籽粒数/检测籽粒总数）×100

某类菌分离频率（%）=（带某类菌籽粒数/带菌籽粒总数）×100

1.2.4 病原菌鉴定 将内部检测分离到的真菌转移到新的PDA培养基进行纯化培养，根据病原菌的菌落形态，以及分生孢子的有无、大小、形态等特征对分离到的病原菌进行初步鉴定[24-25]。提取病原菌基因组DNA并进行PCR扩增，扩增引物为通用引物ITS1（TC CGTAGGTGAACCTGCGG）与ITS4（TCCTCCGCTT ATTGATATGC）、EF1（ATGGGTAAGGARGACAAG AC）与EF2（GGARGTACCAGTSATCATGTT），PCR反应体系：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的上游引物和下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR程序：95℃预变性10 min；95℃变性1 min，53℃退火30 s（退火温度视引物而定），72℃延伸45 s，共38个循环；72℃延伸10 min，4℃保存扩增产物。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果于NCBI网站进行Blast比对。

1.3 数据处理

利用Excel 2010对试验数据进行分析整理。将不同地区计算得来的所有果穗样本的孢子负荷量和籽粒带菌率以及检测分离到的各真菌的分离频率进行数据录入，并计算不同地区各时期4个果穗检测结果的平均值。

2 结果

2.1 不同地区玉米籽粒的带菌量

对黄淮海夏玉米区玉米籽粒内部及外部带菌量进行统计分析，图1为籽粒内部及外部带菌检测结果。每个地区取4个果穗籽粒带菌率及孢子负荷量的平均值（表2），结果显示，试验样本籽粒带菌量均较大，不同地区采集的乳熟期籽粒的孢子负荷量在0—1 886个/粒，均值为439个/粒；籽粒带菌率在0—65.0%，均值为23.6%；不同地区采集的完熟期籽粒的孢子负荷量在18—2 658个/粒，均值为942个/粒；籽粒带菌率在10.0%—100.0%，均值为59.6%。乳熟期与完熟期的籽粒带菌率与孢子负荷量差异均较大，检测的90个地区中，86个地区完熟期籽粒的孢子负荷量大于乳熟期籽粒的孢子负荷量，87个地区完熟期籽粒带菌率大于乳熟期籽粒带菌率。

同一地区的籽粒带菌率与孢子负荷量并未发现具有明显的相关性，以完熟期为例，安徽省蚌埠玉米籽粒带菌率仅为10.0%，而孢子负荷量却高达1 458个/粒；河南省新郑玉米籽粒带菌率为100.0%，籽粒表面的孢子负荷量仅为275个/粒。

不同省份和地区的玉米籽粒带菌情况不同。以完熟期为例，河南省睢阳市、新郑市玉米籽粒的带菌率达100.0%，山东省诸城、河北省滦平玉米籽粒的带菌率分别为92.3%和87.5%，而安徽省蚌埠、河南省商丘、山东省郓城、河北省新乐的籽粒带菌率较少，分别为10.0%、42.5%、20.0%和37.5%；河南省襄县、山东省莒县和河北省涿州市玉米籽粒的孢子负荷量分别为2 658、2 228和2 160个/粒，河南省淮阳、山东省临沂市和河北省武强县完熟期玉米籽粒的孢子负荷量较少，分别为18、350和33个/粒。不同省份总体带菌量也有差异，4个省份中乳熟期及完熟期孢子负荷量由大到小依次为河南、山东、河北、安徽。4个省份乳熟期籽粒带菌率由大到小依次为河南、山东、河北、安徽，完熟期籽粒带菌率由大到小依次为河南、河北、山东、安徽。

2.2 玉米籽粒携带病原菌的种类

2.2.1 玉米籽粒外部携带病原菌的种类 经检测玉米籽粒外部主要携带真菌有镰孢菌、青霉菌、曲霉菌、链格孢菌（spp.）、木霉菌、根霉菌（spp.）、毛霉菌（spp.）、蠕孢菌（-spp.）等；镰孢菌的分离比例最大，其次是青霉菌，再次为曲霉菌。不同省份孢子负荷量及外部携带镰孢菌、青霉菌、曲霉菌的分离比例见表3。乳熟期镰孢菌的分离比例在53.7%—62.6%，均值为59.1%，青霉菌和曲霉菌的分离比例较小，分别在6.5%—13.8%与0—1.9%，均值分别为8.9%与0.7%。完熟期籽粒外部镰孢菌分离比例最大，在58.7%—83.3%，均值为71.9%；青霉菌分离比例次之，在11.6%—22.9%，均值为17.0%；曲霉菌分离比例在0.2%—2.2%，均值为0.9%。4个省份中，山东省镰孢菌所占分离比例最大，为83.3%，曲霉菌分离比例偏大，为2.2%。

表2 不同地区籽粒带菌结果

A—C：玉米籽粒外部带菌检测图片The external detection of maize grains；D—F：玉米籽粒内部带菌检测图片The internal detection of maize grains

表3 不同省份玉米籽粒外部携带主要真菌的分离比例

2.2.2 玉米籽粒内部主要病菌类群的种类鉴定及出现频率 通过对360份完熟期玉米穗样本内部带菌检测，发现镰孢菌、青霉菌、曲霉菌的分离频率较大，对其进行纯化培养，并经过形态学和分子生物学方法鉴定病原菌种类及分离频率（表4），发现优势菌属为镰孢菌属，主要分离到轮枝镰孢、层出镰孢（）、禾谷镰孢（），其中轮枝镰孢所占分离频率最高，平均分离频率为29.7%，层出镰孢次之，平均分离频率为25.9%，禾谷镰孢分离频率较低，平均分离频率仅1.3%。青霉菌主要为绳状青霉（）和草酸青霉（），分离频率分别为5.0%和3.6%，除安徽省外，其余3省草酸青霉分离频率均大于绳状青霉，安徽省未分离到草酸青霉，仅分离到绳状青霉。曲霉菌主要为黄曲霉（）和黑曲霉（），分离频率分别为1.4%和1.2%。黄曲霉产生黄曲霉毒素具有致癌性，河北省黄曲霉的分离比例最低，为0.6%，安徽省黄曲霉的分离比例较高，为2.0%。除镰孢菌、青霉菌、曲霉菌外，还检测到其他真菌，包括非洲哈茨木霉（）、链格孢（）、玉米生离蠕孢菌（）、稻黑孢霉（）、紧密帚枝霉（）等。

表4 不同省份玉米籽粒内部分离病原菌种类及分离频率

2.2.3 玉米籽粒内部主要病原菌的分离频率 经检测玉米籽粒内部主要携带真菌有镰孢菌、青霉菌、曲霉菌、链格孢菌、木霉菌、根霉菌、稻黑孢菌、帚枝霉菌、毛霉菌、蠕孢菌等。不同省份籽粒带菌率及内部携带镰孢菌、青霉菌、曲霉菌的分离频率见表5。结果显示镰孢菌的分离频率最大，青霉菌次之，曲霉菌最低，与籽粒外部带菌种类检测结果一致。乳熟期镰孢菌的分离频率在25.2%—43.7%，完熟期镰孢菌的分离频率在49.2%—65.2%，其中山东省完熟期镰孢菌的分离频率最大，为65.2%；乳熟期青霉菌的分离频率在4.0%—8.9%，完熟期青霉菌分离频率在7.6%—11.8%，安徽省完熟期青霉菌分离频率最大，为11.8%；曲霉菌在乳熟期与完熟期的分离频率分别在1.3%—3.1%与2.0%—3.1%，河北省乳熟期曲霉菌分离频率最大，为3.1%。

3 讨论

通过对黄淮海夏玉米区90个市/县采集的玉米果穗进行带菌检测，结果表明不同熟期表面无症状籽粒均携带大量病原真菌，主要与病原菌的潜伏性有关。

表5 不同省份玉米籽粒内部携带主要真菌的分离频率

穗腐病是造成玉米籽粒带菌的主要原因，穗部虫害可加重穗腐病的发生，是造成病原菌侵染的重要因素[27-28]，穗腐病是玉米生长后期发生的重要病害，由于在玉米生长后期，果穗迅速脱水，苞叶开始松散，病穗上、空气中的真菌孢子可通过气流传播到其他果穗的籽粒表面，因此，表面无症状的果穗上也可能携带大量病原菌。在玉米脱粒过程中，发生穗腐病的籽粒可能会被去除，剩余的无症状籽粒会被进一步加工成饲料等加工品，直接影响人畜安全。因此应加强对玉米籽粒真菌生长的细致性检测与鉴定，加强对玉米的储存方式、温度和湿度等因素良好的控制。

玉米乳熟期是籽粒中各种营养物质迅速积累的时期，试验发现，乳熟期玉米籽粒仍有较高的带菌率。河北涿州、河南洛阳、平顶山、邓州、山东莱阳、济宁、安徽蒙城地区乳熟期孢子负荷量均大于1 200个/粒；河北无极、河南夏邑、太康、邓州、原阳、辉县；山东济阳、齐河乳熟期籽粒带菌率在50%以上。其中河南邓州不仅孢子负荷量较大（1 632个/粒），籽粒带菌率也较高（65%），表明病原菌在乳熟期之前就已经侵入，因此穗腐病防治需提前到抽雄吐丝期。在玉米吐丝期可用65%代森锰锌可湿性粉剂400—500倍液喷果穗，预防病原菌的入侵[29]。完熟期籽粒带菌量大于乳熟期，主要是因为玉米主要病害大多发生在生长后期，尤其玉米穗腐病在灌浆期开始发生，乳熟期至蜡熟期表现症状，且多从果穗顶端开始蔓延，逐渐向下侵染[4]。黄淮海地区属于温带季风气候，降雨集中在每年的6—8月份，此时正值夏玉米生长季节，适宜大多真菌的生长，很容易发生穗腐病，随着果穗慢慢成熟，霉菌的数量会逐渐增加，因此完熟期的玉米籽粒带菌量高于乳熟期。

本研究还发现，玉米籽粒内部和外部均携带的真菌种类包括镰孢菌、青霉菌、曲霉菌、链格孢菌、木霉菌、根霉菌、蠕孢菌、毛霉菌，其中镰孢菌、青霉菌、曲霉菌为分离获得的主要真菌。胡晓芬等[21]采用洗涤检测法对7个玉米品种进行了种子表面带菌检测，与本研究所用方法一致，结果表明供试种子表面携带的真菌主要为青霉菌、根霉菌、镰孢菌和链格孢菌，与本研究分离到的真菌种类部分重叠；蒋孟多等[22]采用滤纸培养基法和PDA培养基法同样对这7个玉米品种进行种子内部带菌检测，发现滤纸培养基法在检测过程中由于只有温度和光照条件，导致带菌种类单一，不能准确反应种子带菌情况；采用PDA培养基法，培养5—7 d均出现带菌情况，且带菌种类和带菌量各不相同，因此采用PDA培养基法检测种子内部带菌较好。

分子鉴定研究发现，镰孢菌属中轮枝镰孢为优势菌株，与前人[16,30-32]鉴定结果一致，禾谷镰孢也是引起玉米穗腐病的优势病原菌之一[33]，但本研究中禾谷镰孢的分离比例仅为1.3%。轮枝镰孢在玉米上引起的穗腐病主要以粒腐为主，表面危害较小，但对于表面无病症但是带菌量较大的籽粒的危害不容忽视，在后续贮藏工作中，遇到适宜的条件仍可能会发生霉变，产生伏马毒素，伏马毒素是一种霉菌毒素，是由轮枝镰孢产生的代谢产物[34]。青霉菌的分离比例次之，青霉菌产生的展青霉素、桔青霉素、黄绿青霉素、红色青霉毒素等对玉米饲料安全存在威胁。曲霉菌的分离比例最小，但是其产生的黄曲霉毒素具有强烈的致癌、致畸和致突变作用，其毒性是砒霜的68倍，是氰化钾的10倍[35-36]，黄曲霉毒素污染较为普遍[37-39]。

为了预防玉米籽粒真菌毒素污染，通过培育和种植抗病品种是解决毒素污染最为经济有效的措施。此外通过农艺措施如种植密度不宜过大，保证田间的通风透气，并且可以通过合理灌溉增加土壤湿度，最好在收获前3—5周内适当灌溉，避免遭受干旱胁迫，降低收获前真菌污染。同时应尽量避免由于玉米贮藏不当导致的带菌率高的现象，由于就地贮藏是玉米贮藏普遍采用的一种方法，玉米果穗堆积在一起，较长的一段时间内处于非通风状态，受污染或残留的霉菌会重新繁殖。因此玉米在收获后要进行充分晾晒，使玉米含水量不超过13%，并采用科学的方法安全贮藏。

4 结论

黄淮海夏玉米区玉米籽粒内外带菌量完熟期大于乳熟期，玉米籽粒在乳熟期仍有一定的带菌量，完熟期籽粒带菌量较大。玉米籽粒内部以及外部均携带的真菌有镰孢菌、青霉菌、曲霉菌、链格孢菌、木霉菌、根霉菌、蠕孢菌、毛霉菌，其中镰孢菌、青霉菌、曲霉菌为分离获得的主要真菌，镰孢菌属中轮枝镰孢为优势菌，青霉菌属中绳状青霉和草酸青霉为优势菌，曲霉菌主要为黑曲霉与黄曲霉。不同地区籽粒带菌量不同，河南省的玉米籽粒带菌量较大，安徽省带菌量最小，其余两省差异不明显。

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（（责任编辑 岳梅）

Detection and Analysis of Fungi Carried by Maize Grain in Huang-Huai-Hai Summer Maize Region

JIN Liuyan, GUO Ning, Shi Jie, ZHANG Haijian, LIU Shusen, ZHANG Jiaqi

(Plant Protection Institute, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Science, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to determine the amount of fungi carried in maize grains in Huang-Huai- Hai summer maizeregion, and to provide reference for safe production, storage, processing and quarantine of maize.【Method】A total of 720 maize ears were collected at the stages of milk-ripening and full-ripening in 90 cities or counties in 4 provinces (Hebei, Henan, Shandong, Anhui) of the Huang-Huai-Hai summer maize region, 4 full maize ears with no symptom on the surface were sampled in each city or county. All samples were tested for the amount and species of fungi carried, including external and internal tests of maize grains. Washing detection method was used to calculate the spores load on the grain surface, the spore load on the grain surface and isolation rate of each genus were calculated by counting the total number of colonies and dilution multiple. The PDA plate method was used for internal detection. Ten grains tested externally were sterilized and cultured on PDA plate. The fungi carrying rate of grains and the isolation frequency of each genus of fungi were calculated by counting the fungi carrying rate of each grain. In addition, the morphological and molecular identification of the higher frequency fungi were carried out. 【Result】The samples carried a large number of fungi. the spores load of the tested samples ranged from 0 to 1 886 per grain, with an average of 439 spores per grain at milk-ripening stage, the fungi-carrying rate of grains ranged from 0 to 65.0%, with an average of 23.6%. The spores load ranged from 18 to 2 658 per grain, with an average of 942 spores per grain at full-ripening stage, the fungi-carrying rate of grains ranged from 10.0% to 100.0%, with an average of 59.6%. The amount of fungi carried in full-ripening stage was higher than that in milk-ripening stage, but in some areas, the amount of fungi carried was still large in milk-ripening stage. There were differences in the amount of fungi carried in maize grains in different areas. The amount of fungi carried in maize grains in Henan Province was the largest, and Anhui Province had the least amount of fungi, Hebei Province and Shandong Province were in the middle and the difference was not significant. Fungal communities carried both inside and outside of maize grains includedspp.,spp.,spp,spp.,spp.,spp.,-spp.,spp. The isolation rate ofspp. in the grain external and internal detection was 59.1% and 36.1% respectively at milk-ripening stage, indicating that a large number ofspp. occurred at milk-ripening stage of maize. The isolation rate ofspp. andspp. in external grains was 8.9% and 0.7% respectively, and the isolation frequency in internal grains was 6.0% and 1.9% respectively, indicating thatspp. andspp. had begun to infect maize ear at milk-ripening stage. The isolation rate ofspp. in the grain external and internal detection was 71.9% and 58.5% respectively at full-ripening stage, the isolation rate ofspp. andspp. in external grains was 17.0% and 0.9% respectively, and the isolation frequency in internal grains was 9.3% and 2.6% respectively, indicating thatspp.,spp. andspp.were the main fungi carried by maize grains in Huang-huai-hai summer maize region. Morphological and molecular identification results showed thatwas the dominant strain inspp., the isolation frequency of,,was 29.7%, 25.9%, 1.3%, respectively.andwere the dominant strains inspp., and the isolation frequency was 5.0% and 3.6%, respectively.andwere the dominant strains inspp.,and the isolation frequency was 1.4% and 1.2%, respectively. 【Conclusion】the maize grains with no surface symptom carried a large number of fungi in both milk-ripening and full-ripening stages, and the amount of fungi carried in the full-ripening stage is higher than that in the milk-ripening stage.spp. is the most frequently isolated fungi in Huang-huai-hai summer maize region andis the dominant strain. It is the dominant pathogen carried by local maize grains.

maize grain; fungi detection; isolation frequency; Huang-huai-hai summer maize region

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.18.007

2018-04-21；

2018-06-25

国家现代农业（玉米）产业技术体系（CARS-02）

金柳艳，E-mail：jinliuyan216@163.com。通信作者石洁，E-mail：shij99@163.com