GGNBP2与GGN在小鼠睾丸生精细胞定位及作用

郭凯敏 梁作文 田润辉 刘凌云*

1. 吉林大学第一医院男科（长春 130021）; 2. 吉林大学第一医院心理卫生科

不孕不育是一种威胁人类生殖健康的疾病，也是困扰世界医学界的难题。据报道，全世界约10%～15%的夫妻患有不孕不育，其中男性因素约占30%～55%。近几年，环境问题尤其是环境对男性精子的影响越来越受到关注。配子生成素结合蛋白2（gametogenetin binding protein 2 ，GGNBP2），又称锌指蛋白403，于2001年由Ohbayashi首次报道[1]。 已有大量研究表明该蛋白表达与卵巢癌[2,3]、喉癌[4]、乳腺癌[5]、脑胶质瘤[6]密切相关。该基因在睾丸组织中高表达，在精子发生中发挥重要作用。Chen报道GGNBP2缺失影响睾丸形态以及SOX-9支持细胞的功能[7]。我们前期研究也报道GGNBP2敲除引起雄性小鼠无精子症，生精过程阻滞于精子细胞，生精上皮管腔完整性破坏，精子顶体畸形[8]。本实验通过免疫荧光、免疫沉淀技术，探讨GGNBP2与配子生成素（GGN）关系，以及Ggnbp2基因敲除对GGN mRNA和蛋白水平的影响及定位改变，从而初步揭示Ggnbp2基因缺失引起睾丸生精障碍的机制。

材料和方法

一、实验动物和主要试剂

Ggnbp2基因敲除小鼠先由C57BL/6雌性小鼠与野生型129/Sv雄性小鼠交配获得杂合型，然后杂合型Ggnbp2小鼠交配最终获得纯合型敲除小鼠。动物合格号：SCXK（京）2014-0013。配子生成素结合蛋白2抗体（GGNBP2）（美国Pacific Immuno.Corp）、配子生成素（GGN）抗体（美国Aviva System Biology）、β-Actin（美国Santa Cruz Biotech.公司）、二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔或山羊抗鼠IgG（美国Santa Cruz Biotech.公司）。SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），二氧化碳培养箱（德国Binder公司）。敲除小鼠基因型鉴定PCR正向引物: 5’ AGTGCCATTTACCCACCAAG 3’ 反向:5’ GAAAGGAGGAGGGAAAGGAA 3’。CKX41-A32PH倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）。低速离心机（美国Sigma公司）

二、免疫共沉淀检测蛋白相互作用

睾丸组织蛋白浓度测定后，分装3管，200μg蛋白量用于免疫沉淀，50μg蛋白加入1/3体积3×loading buffer 煮沸10min，用于Input。PBS清洗agarose A/G 珠子两次，加入用于免疫沉淀的蛋白裂解液，加RIPA（含有蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂）至200μL，再加入等体 2×沉淀缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，300mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1%TritonX-100，pH 8.0），4℃沉淀1h。3 000×g离心，将上清液移至新管，1管加入1μg相应抗体，另一管作为IgG对照，每管中分别加入20μL蛋白A/G 珠子，4℃旋转过夜。次日用洗脱液A（50mmol/L Tris-HCl， 1mmol/L EDTA，0.5%TritonX-100, pH 8.0）洗涤珠子3次， 洗脱液B（10mmol/L Tris-HCl，0.1%TritonX-100 pH7.5）洗涤1次，低速离心，弃上清，加入40μL RIPA与1/3体积3×loading buffer混合，100℃煮沸10min，离心后，加入20μL上样到SDS-PAGE胶，进行电泳，剩余-20℃保存。

三、睾丸生精细胞的分离

取睾丸组织，置于室温1×KREBS 液，剔除附睾、输精管、睾丸白膜后，置于50mL 管中，加入浓度为1mg/mL胶原酶5mL和2mg/mL胰蛋白酶，置于33℃温水浴孵育，静置5min，弃上清，加入3μL DNAse，100μm过滤网过滤，取细胞悬液显微镜下观察细胞形态，可见分散的睾丸各级生精细胞。PBS洗涤两次，用于后续检测。

四、RT-PCR 检测基因表达

应用T R I z o l试剂盒（按说明书操作）提取睾丸组织分离的生精细胞R N A，进行R T-P C R检测。设计G G N 正向引物：5’GGCTGAGATAATATTGGAGGACAG 3’ ，反向引物：5’ GAAGAGCCCGTGGGTTT 3’ 。引物由上海生工技术服务公司合成。PCR反应条件：95℃、3min，94℃、40s；57℃、50s，72℃、1min，30个循环；72℃、7min。PCR产物相对表达水平=靶基因相对灰度值/ β-Actin，蛋白相对表达水平=靶蛋白相对灰度值/ β-Actin。

五、免疫印迹检测蛋白水平的表达

取新鲜睾丸组织，去白膜后，加入适量RIPA细胞裂解液Brandford，组织匀浆器冰上操作20s，超声波粉碎仪裂解处理10s后，4℃高速12 000×g离心15min；Brandford蛋白定量后SDS-PAGE电泳，电压120v，PVDF湿转（电压150v，120min），5%脱脂牛奶封闭1h，一抗4℃孵育过夜，次日TBS-T洗膜3次，每次5min，相应二抗室温孵育1h。X片暗室曝光，计算机扫描条带，并与β-Actin条带进行对比分析获得各自相对表达水平。

六、精母细胞染色体分散实验和免疫荧光、免疫组化检测

实验方法依照Kobayashi报道[9]。 取30d小鼠睾丸组织，剔除白膜后，低渗缓冲液（30mmol/L Tris-Base，50mmol/L蔗糖 ，17mmol/L 二水枸橼酸三钠，5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，0.5mmol/L PMSF ，pH8.2），室温作用30～60min。滴100mmol/L蔗糖溶液于载玻片，取少许睾丸组织置于其上，组织剪剪碎至小块，用盖玻片左右推片3～4次，将1%PFA溶液滴于覆盖的玻片上，湿盒固定1h，使用前PBS洗1～2次。10%donkey 血清室温封闭1h，用待检测抗体4℃孵育过夜。次日分别加入含有荧光的二抗，避光孵育1h，DAPI复染，荧光显微镜观察。肉眼计数免疫染色Foci改变。

成年雄性小鼠睾丸经脱水、固定、石蜡包埋后切片，经脱蜡、过氧化氢灭活、高温抗原修复处理、4%羊血清封闭后，加入一抗4℃过夜。次日加入相应二抗孵育，DAB 显色和复染，在苏木素染色液中复染 30～60 s，经梯度酒精脱水、透明，封片保存。

七、统计学分析

采用SPSS17.0 统计学分析软件进行分析。所有计量资料均符合正态分布。组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05认为有统计学差异。

结 果

一、GGNBP2与GGN相互作用

采用野生型成年小鼠睾丸组织蛋白200μg，行免疫沉淀，结果提示GGN能够沉淀GGNBP2，同时GGNBP2也能够沉淀GGN，提示GGNBP2与GGN相互作用，见图1。

二、GGNBP2与GGN在精母细胞和精子细胞的定位。

分离60d野生型小鼠睾丸生精细胞，应用免疫荧光观察精母细胞和精子细胞4个期间（Golgi, Cap, Acrosome和Maturation phases）GGNBP2与GGN的表达定位，DAPI标记细胞核，结果显示GGNBP2与GGN均定位于精母细胞的细胞核和细胞浆，且在精子细胞 高尔基体期（Golgi）和 头帽期（Cap ） 定位于细胞核和细胞浆，而顶体期（Acrosome ）定位于胞浆和顶体，最后在成熟期（Maturation）表达于精子尾部（图2）。

图1 免疫共沉淀检测 GGNBP2与GGN相互作用

图2 免疫荧光检测GGNBP2 与GGN在精母细胞以及精子细胞4个期的共定位

三、Ggnbp2基因敲除对Ggn 基因 和蛋白表达以及定位的影响

分离30d和60d野生型和Ggnbp2KO小鼠睾丸生精细胞，PCR和Western blot结果提示Ggnbp2基因敲除小鼠生精细胞mRNA和蛋白表达均下降，且有显著性差异（图3）。

免疫组化结果提示GGN高表达于睾丸组织生精小管精母细胞核、精子细胞以及成熟精子的细胞核和细胞浆，而在Ggnbp2基因敲除睾丸生精小管，可见精子细胞数量明显减少，而GGN主要表达于精母细胞细胞核（图4）。

同时染色体细胞核分散免疫荧光进一步提示Ggnbp2基因敲除引起GGN表达局限于细胞核，胞浆染色荧光强度显著减弱（图5）。

图3 Ggnbp2基因敲除对GGN基因和蛋白水平的影响

图4 免疫组化检测GGN在两组睾丸生精小管中表达（×100）

讨 论

GGNBP2，又被称为DIF-3 或ZNF403，是锌指蛋白家族进化过程中的一种保守蛋白，在睾丸中的表达水平远高于其他组织，其生理功能与生殖过程密切相关。GGNBP2作为配子生成素（Ggn）的结合蛋白，后者是小鼠生殖细胞特异基因，其可变剪接产物配子生成素蛋白1（GGN1）、蛋白2（GGN2）和蛋白3（GGN3）在生殖细胞特定发育阶段的特异性表达[10]。酵母双杂交实验证实GGNBP2 能够与GGN1、GGNBP1以及OAZ3 相互作用，在精子发生过程中起决定作用[10,11]。我们用免疫沉淀进一步证实GGNBP2与GGN相互作用，形成蛋白复合体，参与精子发生。

既然 GGNBP2与GGN都高表达于睾丸组织，其在生精过程中定位情况如何。Jamsai等[12]研究发现GGN1蛋白表达最早出现在减数分裂粗线期精母细胞，并在圆精子细胞中高表达，其富含158个氨基酸序列的羧基结构域可与富含半胱氨酸的分泌蛋2（CRISP2）的离子通道调节区结合，共表达于精子尾部，提示可能精子的活动。Lu等更加明确了GGN的3个剪切体分别定位于核膜、胞浆和细胞核[10,13]。我们采用免疫荧光，观察精母细胞以及精子细胞4个期（Golgi, Cap, Acrosome和Maturation phases）GGNBP2与GGN的定位改变，发现GGNBP2与GGN在精母细胞和精子细胞中定位完全吻合，且在精子细胞 Golgi和Cap 期 定位于细胞核和细胞浆，而Acrosome 期定位于胞浆和顶体，最后在Maturation期表达于精子尾部，这一发现也进一步提示GGNBP2与GGN一样，同时参与精子的活动。此外，Jamsai等在他的另一项研究中报道了[14]GGN完全缺失引起胚胎移植前死亡，没有存活囊，而Ggn杂合型敲除小鼠能存活，DNA双链损伤修复受损，以此推测GGNBP2可能也参与DNA双链损伤修复。

图5 免疫荧光检测Ggnbp2基因敲除对GGN在精母细胞定位变化

研究显示小鼠POG蛋白（proliferation of germ cells）缺失引起原始生殖细胞缺陷，导致小鼠生精异常，精母细胞和精子细胞数量显著低于正常[15]。而GGN能与POG蛋白相互作用，调控POG 蛋白定位[10]，在精子发生中起重要作用。基于上述研究，我们用Ggnbp2基因敲除动物模型，验证基因缺失对GGN的mRNA和蛋白、以及细胞定位的影响。结果发现，Ggnbp2基因敲除能显著降低GGN mRNA和蛋白水平，在未成年和成年小鼠均有抑制作用。我们前期实验发现GGNBP2 mRNA水平在小鼠出生后14d开始升高，直到性成熟期都保持较高的水平，而且mRNA在精母细胞和精子细胞高表达，睾丸支持细胞低表达。而GGNBP2蛋白在精母细胞、精子细胞以及成熟精子均表达[8]。GGN免疫组化结果也证实GGN同GGNBP2定位一致，在精母细胞和精子细胞、成熟精子高表达，且主要表达于细胞核和细胞浆。Ggnbp2基因敲除，GGN主要定位于细胞核。染色体细胞核分散结合免疫荧光进一步证实Ggnbp2基因敲除引起GGN在精母粗线期、双线期、终变期主要集中在细胞核，而且荧光强度明显减弱。从而我们推测，Ggnbp2基因敲除引起小鼠生精功能缺陷主要通过降低GGN表达，改变GGN细胞定位， DNA双链损伤修复机制受损而引起。

我们下一步将围绕GGNBP2如何引起DNA双链损伤修复受损以及涉及的一些重要DNA损伤修复蛋白进行深入研究，进而揭示其导致生精功能障碍的机制。