Lamp2a表达下调对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响

余思颖 金晓霞 高 攀 张 农

(复旦大学基础医学院病理学系 上海 200032)

全球肿瘤导致的常见死亡原因中肝癌位居第2位,主要集中在发展中国家,2012年发生率约占全球新增病例的83%,其中约50%的新增病例发生在中国[1]。随着分子生物学技术的发展,肝癌的临床诊断和发病原因及其相关机制的研究越来越深入。

溶酶体相关蛋白(lysossomal associated protein,Lamp)是溶酶体膜蛋白家族的统称,该家族成员结构相似,但功能未知。Lamp2膜蛋白有3种剪切体,即Lamp2a、Lamp2b和Lamp2c[2],分布在不同的组织。肿瘤细胞中Lamp2a高度糖基化,而糖基化与肿瘤的迁移密切相关[3]。有研究表明,在乳腺癌中Lamp2a的表达与细胞的增殖能力及肿瘤细胞在氧化应激条件的存活有关[4]。这些均提示Lamp2a的表达差异与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。

肿瘤侵袭迁移能力的改变与细胞形态学的改变相辅相成。上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与胚胎发育进程并且发挥着重要作用,机体损伤后一些上皮细胞依赖于EMT作用重建上皮细胞层。研究表明抑癌基因的突变及在致癌基因的作用下,肿瘤恶变上皮细胞通过EMT进程获得侵袭迁移的能力;同时,多个转录因子及其相关的信号通路协调参与调控EMT相关的机制。溶酶体是提供物质代谢产物及小分子物质的重要场所,Lamp2a是溶酶体膜相关蛋白家族的成员,与肿瘤代谢相关因子的调控密不可分。因此,我们推测肝癌与Lamp2a表达有关,Lamp2a表达可能对肝癌细胞生物学行为发挥着重要潜在作用。本文旨在研究Lamp2a表达对肝癌细胞运动、侵袭能力的影响及其相关的信号通路。

材 料 和 方 法

细胞培养人肝癌细胞系MHCC-97H由复旦大学肝癌研究所提供,用含有10%FBS(美国Gibco公司)的DMEM高糖培养基培养,细胞于含5%CO2、37 ℃恒温培养箱内进行培养。人肝癌细胞系SMMC-7721用含有10%FBS的DMEM高糖培养基培养,细胞培养于5% CO2、37 ℃的恒温培养箱内进行培养。

瞬时转染处理siRNA序列由上海拓然生物科技公司设计,序列如下:5’-CTGCAATCTGA-TGATTATT-3’。转染前一天在6孔板中铺板,待细胞长至40%汇合时,用Lipo2000进行转染,在37 ℃含5%CO2的恒温培养箱内培养,转染4～6 h,更换为2 mL新鲜的培养基。

qRT-PCR检测用qRT-PCR检测小干扰Lamp2a的干扰效率。检测干扰组和对照组Lamp2a mRNA水平。将转染过后的细胞用PBS清洗后,加入预冷的Tizol吹打裂解后提取总RNA。提取的RNA用逆转录试剂盒反转录成cDNA,进行qRT-PCR。配置总体积为10 μL的qRT-PCR体系:SYBR Primix Ex Taq 5 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL、PCR前引物0.2 μL、PCR后引物0.2 μL、cDNA模板1 μL,ddH2O 3.4 μL。qRT-PCR反应条件:预变性95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,重复40个循环。

Westernblot检测Western blot检测MHCC-97H细胞干扰前后Lamp2a蛋白质水平,Lamp2a兔抗(美国Abcam公司,ab18528,按1∶1 000稀释)。待细胞长至80%汇合时,用RIPA裂解细胞,再用BCA法检测蛋白质浓度。配置SDS-PAGE凝胶电泳后转膜,抗体于4 ℃孵育过夜,第2天洗膜3次后用二抗孵育1 h再洗膜3次,发光并记录结果。

Transwell小室运动和侵袭实验侵袭实验将冻存于-20 ℃的Matrigel胶置于4 ℃化为液态,预冷实验所需的枪头和培养基;按照工作浓度混匀后加至小室上室,每孔100 μL,放入37 ℃培养箱中凝固2 h;吸取析出的培养基,用胰蛋白酶消化细胞制成细胞悬液并计数,调整细胞悬液浓度为106个/mL。取200 μL细胞悬液加至小室上室中,小室下室加入600 μL含10%FBS的培养基,37 ℃培养箱中培养24～48 h,观察到有细胞穿出即终止实验。取出小室,PBS洗3次,每次10 min。甲醇固定20 min,PBS洗3次,每次10 min。结晶紫染色10 min,洗净结晶紫,棉签擦去小室内残留结晶紫。拍照记录5个中倍视野细胞个数并求均值。肿瘤细胞运动实验方法同侵袭实验,但无需在小室上室铺Matrigel胶。

统计学分析采用Graphpad 6.0软件对数据进行分析,采用双侧t检验进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

Lamp2asiRNA的干扰效率用Lamp2a siRNA瞬时转染MHCC-97H和SMMC-7721肝癌细胞,分别通过Western blot和qRT-PCR检测Lamp2a siRNA的干扰效率。Western blot检测结果表明,与对照组相比,干扰组Lamp2a蛋白质水平明显下降,差异有统计学意义(图1A、1B,P<0.05)。qRT-PCR检测结果表明,与对照组相比,干扰组目的基因Lamp2a mRNA表达明显下降,差异有统计学意义(图1C,P<0.05)。

A and B:Lamp2a protein level was decreased in MHCC-97H and SMMC-7721 with siRNA compared with control cells detected by Western blot;C:Lamp2a mRNA level was qualitifiedby qRT-PCR.(1)P<0.05.

图1在肝癌细胞株MHCC-97H和SMMC-7721中检测Lamp2a敲低效率
Fig1TheefficiencyofLamp2aknockdowninMHCC-97HandSMMC-7721celllines

Lamp2a促进肝癌细胞体外迁移瞬时转染Lamp2a siRNA后,采用Transwell小室实验观察下调Lamp2a蛋白表达后对肝癌细胞株MHCC-97H细胞运动和侵袭能力的影响,发现干扰组侵袭迁移能力明显弱于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,图2)。同时,在SMMC-7721细胞株中瞬时转染Lamp2a siRNA后也发现同样的结果(图2)。

Lamp2a抑制AKT/GSK3β信号通路PI3K/AKT/GSK3β通路与多种肿瘤临床治疗和疾病发展有关。利用Western blot验证Lamp2a蛋白质对AKT/GSK3β通路的作用,发现下调Lamp2a蛋白质能够抑制AKT的磷酸化,同时检测磷酸化位点丝氨酸473和苏氨酸308位点的磷酸化水平,结果显示与对照组相比,干扰组磷酸化水平均下降,GSK3β水平增加(图3)。

Lamp2a可能参与肝癌细胞EMT过程EMT与细胞的侵袭迁移能力密切相关,干扰Lamp2a后肝癌细胞侵袭迁移能力减弱是否与EMT有关？采用Western blot检测EMT相关蛋白质标志物,结果表明,干扰Lamp2a表达使MHCC-97H和SMMC-7721细胞的上皮细胞标志物E-钙黏素(E-cadherin)上调,间质细胞标志物N-钙黏素下调,波形蛋白(vimentin)下调(图4A和4B)。利用qRT-PCR验证mRNA水平上EMT相关标志物的变化也证实Lamp2a与EMT相关(图4C)。

讨 论

研究表明,Lamp2a参与分子伴侣自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)并且通过分子伴侣自噬对多种疾病的进程产生重要的影响。Lamp2a在乳腺癌[4]、胃癌[5]、肺癌[6]、胶质母细胞瘤[7]均表达增高,并且Lamp2a与肿瘤的生长和预后相关。乳腺癌相关研究发现,在T47D细胞株中过表达Lamp2a能够激活转录因子NF-κB的在细胞核中表达增加,胞质表达降低,而转录因子NFκB1在免疫反应、炎症反应及细胞凋亡密切相关[8-13]。Lamp2a敲低导致肿瘤的抑癌基因野生型p53的表达增加[14],同时Lamp2a能够调控糖酵解进程中的酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶和磷酸甘油酸激酶[5],从而影响肿瘤细胞生长。在饥饿条件下上调Lamp2a表达能够保护肝癌细胞,但是同时在肝癌细胞株HCLM3中上调及在细胞株Huh7中下调Lamp2a蛋白表达时,发现细胞侵袭、运动能力并未受到影响[15]。但是,本研究用siRNA瞬时转染肝癌细胞株MHCC-97H和SMMC-7721下调Lamp2a蛋白表达,通过Western blot和qRT-PCR检测验证了siRNA的干扰效率。Transwell小室实验验证了下调Lamp2a的表达能够明显使肝癌细胞的侵袭能力减弱,细胞运动能力减弱。Lamp2a表达可能参与调控,具有转移潜能肿瘤细胞的运动、侵袭能力。

A and B:The loss expression of Lamp2a could inhibit invasion and migration ability of SMMC-7721 and MHCC-97H cells detected by Transwell assays;C:The number of migratory and invasive cells in the SMMC-7721 and MHCC-97H cell lines.(1)vs.Normal control,P<0.05.

图2敲低Lamp2a能够抑制肝癌细胞侵袭和运动能力
Fig2TheLamp2aknockdowninhibitedtheinvasionandmigrationofSMMC-7721andMHCC-97HcellsdetectedbyTranswellassays

图3 敲低Lamp2a对pAKT (Ser473)、pAKT (Thr308)、AKT 和 GSK3β蛋白质水平的影响Fig 3 The effect of Lamp2a knockdown on the levels of pAKT(Ser473),pAKT (Thr308),AKT and GSK3β proteins

PI3K/AKT/GSK3β信号通路中的信号分子PI3K活化后激活AKT并引起AKT下游信号通路相关的信号分子构象的改变,影响细胞生长、增殖及存活和运动等生物学行为,最终恶化成肿瘤。因此,PI3K/AKT信号分子抑制肿瘤细胞的表型改变,并且可能对癌细胞造成严重杀伤力[16]。活化的AKT分子作用是调控若干细胞的细胞进程,包括细胞存活,细胞周期,细胞生长。研究发现,PI3K/AKT/GSK3β分子还参与了细胞黏附、侵袭迁移[17-18],与肿瘤的发展进程密切相关[19]。AKT的激活能够促进AKT的磷酸化,进一步激活下游信号分子GSK3β。GSK3β是糖原合酶激酶-32个亚型之一,细胞内以活性状态存在,参与调节细胞内多种信号通路[20]。GSK3β的下游有关键分子β-catanin[21]依赖GSK3β的磷酸化位点激活后降解β-catanin,引起与之相关的信号通路变化[22]。AKT和GSK3β不仅影响细胞生长,还在EMT进程中发挥重要作用[18]。

A and B:The lamp2a knockdown improved E-cadherin,but decreased N-cadherin and vimentin detected by Western blot;C:The mRNA levels of EMT associated markers expression was detected by qRT-PCR.(1)vs.Normal control,P<0.05.

图4敲低Lamp2a表达参与EMT进程
Fig4Lamp2aknockdownregulatedEMT

EMT是细胞上皮表型向间质表型转变,反之则称为MET,这个过程在胚胎发育、器官形成以及肿瘤的进展过程发挥重要作用[23]。肿瘤相关信号通路中相关信号分子在EMT进程发生发展起到关键作用[23]。研究发现,缺氧、饥饿、生长因子等信号分子都能够诱导EMT的发生。EMT发生时上皮细胞标志性分子E-钙黏素和角化蛋白表达受到抑制,而间叶细胞表型标志性分子N-钙黏素和波形蛋白表达被诱导表达增加[24-26]。本研究通过功能实验验证,下调Lamp2a的表达能够明显使肝癌细胞侵袭迁移能力减弱;为进一步验证Lamp2a可能参与调控侵袭相关的通路,我们利用Western blot和qRT-PCR检测了E-钙黏素、N-钙黏素及波形蛋白等细胞表型标志物,发现下调Lamp2a能够使上皮细胞表型标志物E-钙黏素表达增加,间叶细胞表型标志物N-钙黏素、波形蛋白表达减少。这些说明Lamp2a参与EMT相关进程,下调Lamp2a可能抑制EMT。

综上所述,本研究发现下调细胞株MHCC-97H和SMMC-7721中Lamp2a表达可能调控AKT/GSK3β信号通路,抑制AKT的磷酸化,增加GSK3β表达;Lamp2a能够上调E-钙黏素,下调间质细胞表型标志物N-钙黏素和波形蛋白表达,参与抑制EMT进程,使肝癌细胞侵袭迁移能力减弱。研究发现Lamp2a在肝癌组织及癌旁组织中表达并不平衡,Lamp2a高表达的患者生存期明显高于Lamp2a低表达的患者,说明Lamp2a表达对患者预后具有重要意义[15],然而Lamp2a蛋白是如何参与调控相关的信号通路并影响下游重要信号分子的机制仍需要进一步的深入研究。