金黄色葡萄球菌和猪链球菌混合感染引发的脑膜炎

殷鑫欢，杨晓宇，徐 雷，鲁令华，曾喻兵，徐志文，2，朱 玲，2

（1.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2.四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130）

金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，同时也存在于人和动物的体表、鼻腔、消化道等部位，是一类条件性致病菌。金黄色葡萄球菌可引起人和动物各种急、慢性感染，包括尿道炎、脊髓炎、心肌炎、肺炎、脑膜炎、肠炎、乳腺炎、败血症等。该菌在侵入机体后分泌多种毒力因子，如溶血素、杀白细胞毒素，前者可破坏红细胞和血小板，造成局部缺血坏死，后者可导致T细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞受损甚至裂解从而影响正常宿主的免疫功能[1]。在动物中，金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的最常见病原之一[2]，过去人们常用甲氧西林和万古霉素等抗生素治疗金黄色葡萄球菌感染[3]，但随着抗生素的广泛使用，已经出现了大量的耐药菌株[4-5]。中国细菌耐药监测报告显示，2016年临床上共检测出金黄色葡萄球菌265 716株，占检出的革兰氏阳性菌的32.3%，位列革兰氏阳性菌首列，其中耐甲氧西林的全国平均检出率高达34.4%。

猪链球菌是一种人兽共患的急性、热性传染病，属于国家规定的二类动物疫病。在我国，猪链球菌病已经成为主要的细菌性疾病，该病表现出急性出血性败血症、心内膜炎、脑膜炎、关节炎、哺乳仔猪下痢和孕猪流产等[6]。根据荚膜抗原的不同，将其分为35个血清型，其中1型、2型、1/2型、7型、9型、14型是引起猪链球菌病的主要血清型，猪链球菌2型流行最广，对猪的致病性亦最强，且能引起人的发病死亡，严重威胁着公共卫生安全[7]。猪群之间可以通过密切接触或者气溶胶的形式传播感染，病原菌通过呼吸道、生殖道和消化道感染，也可经皮肤黏膜创伤感染。

2018年7月四川省乐山市一规模化猪场的保育猪只出现大面积发病，外观表现为猪只关节肿胀，四肢滑行等神经症状。解剖发现关节、心包积液、大脑脑膜充血出血，实验室通过选择大脑脑膜、关节液、心包液涂板进行细菌学检测，同时对猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒分别进行了RT-PCR和PCR检测，结果表明该猪场不存在这两种病毒感染，而在大脑、心包积液、关节积液中均分离到了两种不同形态的细菌，现将检测结果介绍如下。

1 材料与方法

1.1 病料采集

病料采集于2018年7月，来自四川省乐山市一规模化猪场发病猪只的大脑、关节液、心包液。

1.2 主要试剂与动物

胰蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白胨、磷酸氢二钾、琼脂粉、无水葡萄糖、氯化钠、丙三醇购自瑞金特公司，犊牛血清购自 BBI公司，DL 2 000 Marker、2 Taq PCR Master Mix、ddH2O购自宝生物公司，SPF级昆明鼠购自成都达硕实验动物有限公司，细菌基因组提取试剂盒购自TIANGEN公司。

1.3 细菌的分离和纯化

无菌采集病猪的关节积液、脑膜分别接种TSA平板划线，培养皿置于37℃细菌培养箱培养24 h，观察菌落形态。将疑似菌落继续挑单扩大，然后进行革兰氏染色观察细菌形态。将扩大的单一形态的细菌接种TSB肉汤纯培养，37℃、170 r/min培养过夜后取菌液与50%的甘油等体积混合保种，置于-20℃。

1.4 动物试验

动物试验分为两组，每小组选取4只成年系SPF昆明小鼠，第1组选取两只小鼠注射金黄色葡萄球菌，另外两只注射链球菌，第2组全部注射生理盐水。挑取单菌落37°C、170 r/min振荡培养过夜，4°C、5 000 r/min离心5 min收集菌体，用无菌生理盐水悬浮菌体，按 0.2 mL/只（6×108CFU/mL）剂量腹腔注射，对照组注射等量生理盐水。观察并记录小鼠状态和死亡情况，剖检死亡小鼠并分离细菌。

1.5 细菌16S rDNA基因的扩增

应用实验室检测细菌的16S rDNA引物扩增细菌的16S rDNA基因，预期扩增长度为1 465 bp，反应体系（30 μL）：上、下游引物各 0.5 μL（20 μmol/L），细菌基因组 2 μL（320 ng/μL），2×Taq PCR Master Mix 15 μL，ddH2O 12 μL。反应条件：95 °C 5 min；95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 45 s，30 个循环；72°C 7 min，将PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，观察到相应的条带后将PCR产物送至上海生工生物工程公司进行测序，引物序列如表1。

表1 试验中使用到的引物

1.6 药敏试验

药敏试验参照CLSI[8]标准采用纸片扩散法，选择对革兰氏阳性菌效果偏好的药物进行药敏试验，对金黄色葡萄球菌和链球菌各选取14种药物，每组做3个平行对照。选取摇过夜的菌液各150 μL用三角棒均匀涂抹于TSA平板上，静置2 min后用无菌镊子夹取药敏纸片贴于平板表面，37°C培养24 h后，测量各种药敏纸片的抑菌圈直径并判定药敏结果。

2 结果

2.1 细菌的分离培养及镜检

在12～18 h的培养过后，TSA平板上长出了黄色、凸起湿润的中等大小菌落和浅白色、针尖大小的小菌落。经过革兰氏染色观察发现，黄色的菌落染色形态为聚堆状的圆形球菌，较小的菌落染色形态为成对或者短链存在的球菌（图1）。

图1 细菌的革兰氏染色

2.2 细菌致病性试验

第1组注射金黄色葡萄球菌和链球菌的4只小鼠精神萎靡，被毛凌乱，呼吸急促呈现腹式呼吸，双眼紧闭，并且分别在18 h内死亡，而对照组的4只小鼠没有什么明显变化。通过解剖发现，注射两种金黄色葡萄球菌的小鼠肠道出血变红，肝脏边缘出血，肺脏出血。注射链球菌的小鼠肺脏和肝脏边缘均有出血，肠道积聚胶冻样物质。

2.3 细菌16S rDNA扩增

根据16SrDNA基因引物序列扩增出相应1465bp的片段大小（图2）。将扩增产物送至生工生物公司测序获得结果。用DNASTAR软件进行拼接，然后在NCBI上进行比对，结果显示分别是金黄色葡萄球菌和猪链球菌，且同源性分别达到99%，综合分析分离菌落形态特征和16S rDNA基因序列分析结果，证实分离到1株金黄色葡萄球菌和1株猪链球菌。

图2 细菌16S rDNA扩增结果

2.4 药物敏感试验

药敏试验结果如表2和表3，分别选用13种抗生素对两种菌做药敏试验，结果显示金黄色葡萄球菌对头孢唑肟、红霉素、头孢哌酮、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶高度敏感，对氟苯尼考、恩诺沙星中度敏感，对四环素、阿莫西林、氨苄西林耐药；链球菌对头孢唑林、头孢拉定、头孢唑肟、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢他啶高度敏感，对恩诺沙星中度敏感，对多西环素、氨苄西林、青霉素、氟苯尼考、四环素、红霉素耐药。

表2 金黄色葡萄球菌药物敏感性结果

表3 链球菌药物敏感性结果

3 讨论

夏季是很多细菌性疾病多发的时节，通过近期实验室检测发现，猪链球菌、金黄色葡萄球菌易与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染，引发猪只的呼吸系统疾病，同时伴有关节积液、脑膜充血、出血等表现。

由药敏试验结果得知，分离到的该株金黄色葡萄球菌对头孢唑肟、红霉素、头孢哌酮、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶高度敏感，而对四环素、阿莫西林、氨苄西林耐药；链球菌对头孢唑林、头孢拉定、头孢唑肟、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢他啶高度敏感，对多西环素、氨苄西林、青霉素、氟苯尼考、四环素、红霉素耐药。证明常规的头孢药物对于这两种菌的效果比较好，结合之前的实验室检测数据证实头孢唑林对这两种菌的效果都较好，且属于低代次的头孢类药物，在临床防控中应该避免直接就使用头孢三四代药物，这样容易导致细菌的耐药程度提高，不利于之后疾病的防控。