黄芩对弓形虫感染小鼠细胞免疫功能影响的实验研究

王海凤，张新鹃，荆雪宁，唐赛赛

（山东中医药高等专科学校，山东 烟台 264199）

刚地弓形虫是一种条件致病寄生虫，为专性细胞内寄生的原虫，猫科动物是其终宿主和重要的传染源，其中间宿主包括人和哺乳类动物等[1]。孕妇和免疫缺陷的人群（如AIDS）仅轻度感染即可引起严重的后果。妊娠期感染弓形虫可影响胎儿的发育，导致流产、早产、死胎、胎儿畸形等不良妊娠结局的发生[2]。AIDS患者感染易导致弓形虫脑病的出现，严重的极易引起死亡[3]。近年来，随着饲养宠物（尤其是猫）的队伍不断壮大，加大了弓形虫感染的潜在危险。虽然随着诊断方法的不断改进，弓形虫的检出率得到提高，但弓形虫病的治疗仍是当前棘手的问题。目前临床上治疗弓形虫病主要以西药为主，如乙胺嘧啶、磺胺嘧啶等。虽然这些药物对急性感染者体内速殖子的杀灭和抑制有明显的作用，但同时也存在较大的毒副作用。中药是我国医药学的瑰宝，有毒副作用小、低残留的优点，所以越来越多的学者开始将方向聚焦于中药治疗弓形虫病的研究。在中药治疗弓形虫感染的实验报告中，无论单方还是复方制剂，多数涵盖了对黄芩的研究[4-5]。黄芩又名元芩，为唇形科植物黄芩，以根入药。黄芩具有抗菌、抗病毒、免疫增强、免疫调节的作用[6-7]。通过黄芩抗弓形虫感染的实验研究，明确黄芩不能起到直接的杀虫作用[8]，但可显著抑制弓形虫的增殖[9-10]，从而起到抗感染的作用。弓形虫感染后机体的免疫是以T细胞介导为主的细胞免疫，参与机体免疫反应的主要有巨噬细胞、T淋巴细胞、NK细胞及其多种细胞因子[11]。为了初步研究黄芩抗弓形虫感染是否与增强小鼠的细胞免疫功能有关，我们设计了本实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 黄芩 黄芩药材购自山东中医药高等专科学校附属医院，品种鉴定合格。取黄芩适量，用纯水煎制成1 g/ml的溶液，供实验用。

1.1.2 小鼠 清洁级健康昆明雌性小鼠70只，鼠龄6～8周，重18～22 g，购自南京君科生物工程有限公司。

1.1.3 弓形虫强毒株（RH株）速殖子 由山东中医药高等专科学校免疫学与病原生物学教研室提供。

1.1.4 试剂 小鼠血清IL-2 ELISA检测试剂盒，购自上海恒远生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 弓形虫虫体准备 复苏液氮冻存虫体，昆明小鼠腹腔接种，54小时转种一次，共转种3～4次，收集腹腔液内虫体，离心去上清，并用无菌PBS调整虫体浓度为103/ml，严格无菌操作，以下操作也保证无菌进行。

1.2.2 动物模型的建立 将健康昆明雌性小鼠70只随机分为对照组（20只）、感染组（25只）、治疗组（25只）。感染组、治疗组每只小鼠腹腔注射上述弓形虫悬液0.5 ml，约含500个速殖子，对照组腹腔注射等量的无菌生理盐水。治疗组腹腔感染后4小时开始灌胃给药（黄芩药液），剂量为0.5 ml/鼠，灌药量为500 mg/d，感染组、对照组给予等量的蒸馏水，灌胃前2小时禁水禁食，连续给药7天后进行指标检测。对照组、感染组、治疗组小鼠存活量分别为20只、21只、24只。

1.2.3 小鼠外周血中IL-2检测 于灌胃结束后次日对实验小鼠进行眼底静脉取血，收集于0.5 ml无菌EP管中，室温静置1小时，3 000 r/min离心10分钟，采用双抗体加心法ELISA试剂盒测定小鼠外周血中IL-2细胞因子的含量，严格按照试剂盒的说明进行操作。

1.2.4 测定小鼠脾、胸腺指数 称取小鼠体重（g），脱臼处死后剖开胸腹腔，并分离其脾脏、胸腺，用生理盐水清洗，滤纸吸干称重（mg），测定脾、胸腺指数，即：胸腺指数（mg/g）=胸腺重量（mg）/小鼠体重（g）；脾指数（mg/g）=脾重量（mg）/小鼠体重（g）。

1.2.5 小鼠脾淋巴细胞增殖功能检测 测定小鼠脾、胸腺指数后，将小鼠脾脏匀成匀浆，用200目筛网过滤，制备脾细胞悬液，1 500 r/min离心5分钟，弃上清，加入适量红细胞裂解液，震荡3分钟，静置10分钟后离心（4℃，1 000 r/min）10分钟，弃上清，用PBS洗2次，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬，用台盼蓝染色计数，调整细胞密度为5×106/ml[12]。将上述制备的脾淋巴细胞悬液加入96孔U形培养板中，每孔100μl。分别加入 ConA（10 μg/ml）100 μl，使其终浓度为 5 μg/ml，每个标本3个复孔，5%CO2培养箱中培养48小时，培养结束前4小时加入 MTT（5 mg/ml）10 μl，培养结束后 1 500 r/min离心 10分钟，小心吸去上清，加入100μl，DMSO振荡10分钟，使紫色结晶完全溶解，然后静置15~20分钟，用酶标仪550 nm检测各孔吸光度（OD值）[13]。

1.2.6 统计学方法 用SPSS 17.0统计软件分析结果，用（±s）表示，采用两独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠外周血清IL-2含量比较（见表1）

表 1 3 组小鼠外周血清 IL-2 含量比较（±s，pg/ml）

表 1 3 组小鼠外周血清 IL-2 含量比较（±s，pg/ml）

注：与对照组比较，#P<0.01；与感染组比较，*P<0.01

组别对照组感染组治疗组鼠数20 21 24 IL-2含量38.18±2.01 40.63±2.97#48.57±3.26*

2.2 3组小鼠胸腺指数及脾指数比较（见表2）

表2 3组小鼠胸腺指数和脾指数比较（±s，mg/g）

表2 3组小鼠胸腺指数和脾指数比较（±s，mg/g）

注：与对照组比较，#P<0.01；与感染组比较，*P<0.01

组别对照组感染组治疗组鼠数20 21 24胸腺指数1.82±0.17 1.75±0.19 2.08±0.31*脾指数3.44±0.56 3.97±0.66#4.35±0.73*

2.3 黄芩对弓形虫感染小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（见表3）

表3 黄芩对弓形虫感染小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（±s）

表3 黄芩对弓形虫感染小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（±s）

注：与对照组比较，#P<0.01；与感染组比较，*P<0.01

组别对照组感染组治疗组鼠数20 21 24脾淋巴细胞OD值0.356±0.054 0.389±0.019#0.415±0.048*

3 讨论

在本实验研究中，通过小鼠脾、胸腺指数的测定，外周血清IL-2含量的测定及用MTT法测定脾淋巴细胞增殖情况，以初步探索黄芩在抗弓形虫感染时对小鼠细胞免疫功能的影响。在实验研究中，以500个速殖子作为感染剂量，既保证了感染状态，又控制了小鼠的死亡率，有利于研究的开展[8]。

3.1 弓形虫感染小鼠急性期，可诱导细胞免疫

表1~3显示，感染组与对照组相比，弓形虫感染小鼠后可引起IL-2含量、脾指数、脾淋巴细胞OD值显著升高（P<0.01），该实验结果与苑文英[14]的报道相一致。由此表明，在弓形虫感染急性期，弓形虫抗原可激活机体免疫应答，活化T细胞，在体内诱导细胞免疫，并通过效应性T细胞或细胞因子IL-2等抑制虫体繁殖[11，15]。

3.2 黄芩可提高弓形虫感染小鼠外周血清IL-2含量

表1显示，治疗组与感染组相比，小鼠外周血清IL-2含量显著升高（P<0.01），表明黄芩可提高弓形虫感染小鼠外周血清IL-2含量。IL-2主要是由CD4+辅助T（Th）细胞产生的细胞因子，在小鼠体内，只有Th1亚群可产生IL-2，IL-2可参与细胞免疫应答，增强吞噬细胞介导的抗感染机制的作用，特别是抗细胞内寄生菌的感染，诱导并增强细胞毒性T细胞（CTL）反应，增强CTL等穿孔素的表达[16]。有研究表明，对弓形虫感染小鼠注射一定剂量的重组IL-2，能明显增强小鼠抗急性弓形虫感染的能力，可以显著延长小鼠的生存时间，并明显减少慢性感染小鼠脑内包囊的数量，肯定了IL-2在免疫应答中抗弓形虫感染的作用[17-18]。通过本实验研究发现，黄芩可提高弓形虫感染小鼠外周血清IL-2的含量，可能提示黄芩可以通过促进IL-2的分泌和释放来提高小鼠细胞免疫功能，从而间接达到抗弓形虫感染的作用。

3.3 黄芩可提高弓形虫感染小鼠脾、胸腺指数

胸腺是中枢免疫器官，是T淋巴细胞分化成熟的场所，并将成熟的T细胞输出胸腺，移至外周免疫器官。脾脏是体内最大的外周免疫器官（淋巴器官），是成熟的T、B细胞定居和发生免疫应答的重要场所。因此，脾、胸腺两个免疫器官的重量在一定程度上可以反映两个免疫器官内淋巴细胞的数量，从而间接了解体内淋巴细胞总体水平[19]。因此，以胸腺指数和脾指数作为衡量机体免疫功能的重要指标。表2显示，黄芩可显著提高弓形虫感染小鼠脾、胸腺指数（P<0.01）。胸腺指数、脾指数的升高初步表明黄芩可增强弓形虫感染小鼠的免疫功能，以达到抗弓形虫感染的目的。

3.4 黄芩可促进弓形虫感染小鼠脾淋巴细胞增殖

表3显示，黄芩可使ConA激发的小鼠脾细胞（主要是T淋巴细胞）增殖反应明显增强（P<0.01），表明黄芩在抗弓形虫感染过程中可促进T淋巴细胞增殖，提高弓形虫感染小鼠的细胞免疫功能。同时，黄芩可以提高弓形虫感染小鼠的胸腺指数、脾指数，可能也与黄芩促进免疫器官内淋巴细胞增殖有关。

综上所述，黄芩可以显著提高弓形虫感染小鼠脾指数、胸腺指数、外周血清IL-2含量及促进小鼠脾淋巴细胞增殖。由此初步认为，黄芩可以通过增强弓形虫感染小鼠的细胞免疫功能而达到抗弓形虫感染的作用。另外，黄芩对弓形虫感染小鼠免疫细胞的具体调节机制及对其他细胞因子的分泌是否也有促进作用，可在后续做进一步实验研究，以明确黄芩抗弓形虫感染的详细免疫调节机制，并为黄芩抗弓形虫的临床应用提供理论依据。