广西百色地区人群S100B基因rs2839356和rs881827多态性❋

陆玉兰 王 荣 黄华佗 覃海媚 刘纯宏 罗宏成 韦叶生

(右江民族医学院附属医院检验科, 百色 533000)

星形胶质源性蛋白S100B为S100蛋白家族中的重要成员之一,由α和β两种亚基组成,分子量为21kD[1]。S100B广泛分布于星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、脂肪细胞、软骨细胞、皮肤朗格汉斯细胞、淋巴细胞亚群、肌卫星细胞等[2]。S100B是一种具有多种生物学活性的蛋白质,如参与细胞的增殖与分化,调节细胞的凋亡,参与细胞间信号转导以及调节钙离子的平衡等。此外,S100B蛋白可通过与晚期糖基化终产物受体结合后激活转录因子(NF-κB)及p38MAPK 等信号通路,诱导炎症因子的活性,从而导致胶质细胞和神经元的应激与凋亡[3-4]。既往研究表明,S100B蛋白在缺血性脑卒中、黑色素瘤、创伤性脑损伤和自闭症等疾病中扮演重要的角色[5-8]。然而,人们对S100B的研究主要集中在血清水平,关于S100B基因多态性与疾病相关性的研究还比较少。本研究通过分析S100B基因多态性位点基因型和等位基因频率在广西百色地区人群中的分布,并与Hap Map数据库公布的4个人群S100B基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， SNP)分型数据进行比较,探讨S100B基因多态性在不同地区种族人群中的分布差异,为深入研究S100B基因多态性与相关疾病的发病机制提供重要的遗传学理论依据和分子生物学基础。

1 材料和方法

1.1 研究对象

随机选取2016年3～10月到右江民族医学院附属医院体检的体检者398例,其中男性231 例,女性167例,平均年龄(58.09±8.76)岁。所有研究对象均来自广西地区,且相互无血缘关系。排除肿瘤、心脑血管疾病及感染性疾病等。本研究已获得医院伦理委员会的审批。

1.2 基因组DNA提取

采集体检者静脉血3ml,用含有EDTA-K2抗凝剂的采血管保存。采用离心柱法进行基因组DNA提取,-70℃保存备用。

1.3 引物设计与合成

引物用在线Primer3 软件设计(http： //bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/),并由上海天昊生物科技有限公司合成。其中rs2839356位点的上游引物序列为： 5′-TCACCTTCAGGGCAGCTGAGAA-3′,下游引物序列为： 5′-TGGAAGGGAGGGAGACAAGCAC-3′;扩增片段长度为175bp,延伸引物为： 5′-TTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTAAGATAAAGCCAGTGT ACAGATGGAT-3′;rs881827上游引物序列为： 5′-TGTGTGTGGAAGTCCCTGTCTCA-3′;下游引物序列为： 5′-CCCTGCACTGTGGTTGTTCCTC-3′;扩增片段长度为248bp,延伸引物为： 5′-TTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTGTTGCTGAAGTAACT CTTGGGAAC-3′。

1.4 PCR扩增

采用20μl反应体系,其中包括1×GC-I 缓冲液(TaKaRa)、1μl 多重PCR引物、1 U HotStarTaq 聚合酶(Qiagen Inc.)、3.0mmol/L镁离子、0.3mmol/L dNTP、1μl DNA模板,余下体积用经过严格高压灭菌的双蒸水补足。PCR 反应参数为： 95℃预变性2min;扩增阶段为： 94℃预变性20s,65℃退火40s,72℃延伸1.5min,循环11次;94℃预变性20s,59℃退火30s,72℃延伸1.5min,循环24次;最后阶段72℃延长2min。PCR产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获得,PCR产物经过虾碱酶(SAP， Promega公司)和外切酶I(EXO I， Epicentre公司)纯化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用SAP纯化后在ABI3730xl上样。SNP分型用GeneMapper4.1软件分析。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0软件包对实验结果进行统计学分析。两位点基因型及等位基因频率采用直接计数法计算;两组间基因型及等位基因频率的比较均采用χ2检验;采用Hardy-Weinberg遗传平衡检验评估样本的群体代表性。

2 结果

2.1 S100B的基因型检测

S100B基因rs2839356和rs881827位点经Hardy-Weinberg平衡检验,两位点基因型均达Hardy-Weinberg平衡(P值分别0.202和0.902),表明本研究具有群体代表性。测序结果显示,rs2839356和rs881827两位点都包含TT、CT、CC 3种基因型,DNA测序法证实了该结果(图1A、B)。

图1 S100B基因rs2839356和rs881827测序图

2.2 S100B基因rs2839356和rs881827多态性在广西百色地区人群中的分布

统计分析表明,广西百色地区人群中,S100B基因rs2839356、rs881827两位点分别以TT和CT基因型多见,其频率分别为49.2%和48.3%,以T和C等位基因分布频率最高,各占71.1%和58.5%。两位点各基因型和等位基因频率在男、女两组间分布差异均无统计学意义(P>0.05),提示这两个位点基因型和等位基因分布频率在广西百色地区人群中分布与性别无关(表1)。

2.3 S100B基因rs2839356和rs881827位点多态性在不同地区种族人群间的比较

广西百色地区人群S100B基因rs2839356和rs881827位点多态性分布频率与人类基因组单体型图计划(htt： //www.Hapmap.org)公布的Hap Map-CEU (Utah residents with Northern and Western European ancestry)、Hap Map-YRI (Japanese in Tokyo)和Hap Map-CHB (Han Chinese in Beijing, China)3个人群SNP分型数据进行比较,结果显示,广西百色地区人群rs2839356、rs881827两位点的基因型和等位基因频率分布与Hap Map-CEU、Hap Map-YRI和Hap Map-JPT相比差异均有统计学意义(P<0.05);与Hap Map-CHB相比,差异无统计学意义(P>0.05)(表2、3)。

表1 S100B 基因rs2839356和rs881827多态性在广西百色地区人群中的分布(%)

Genotype and allele frequencies of S100B gene showed no significant difference among the same group of male and female (P>0.05)

表2 广西百色地区人群rs2839356位点多态性分布频率与人类基因组单体型图计划扫描所得的其他地区种族人群的结果比较(%)

*P<0.05vsBaise Guangxi

表3 广西百色地区人群rs881827位点多态性分布频率与人类基因组单体型图计划扫描所得的其他地区种族人群的结果比较(%)

*P<0.05vsBaise Guangxi

3 讨论

3.1 研究S100B基因多态性的重要性

流行病学研究表明,遗传背景的差异可以造成不同种族人群对于某些疾病存在不同的易感性,通过研究不同地区人群基因多态性,不仅有助于认识不同种族人群对某一疾病易感性的差异,而且对于研究某些疾病的发病机制及基因水平的诊断和治疗有重要意义。因此,S100B基因多态性的研究是解释相关疾病临床表现多样化的一个有用的方法,在对一些疾病S100B基因的多态性进行研究时,首先了解其在正常人群中的分布特点,是正确分析基因多态性与相关疾病之间关系的前提。

人类S100B的基因位于21号染色体长臂(21q22.3),由3个外显子和2个内含子组成,其mRNA长度为1095bp,编码91个氨基酸。S100B 转录调节机制复杂,当转录被抑制,需要依赖特异性反向因子才能启动它的表达[9]。随着分子生物学技术的发展,人们发现编码S100B基因序列中存在SNP位点,而这些多态性位点可能参与了相关疾病的发生、发展。既往研究表明,S100B基因多态性与阅读障碍症、精神分裂症、自闭症、抑郁症和手足口病等疾病密切相关[10-14]。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的改变,它是人类可遗传变异中最常见的类型,也是个体或者群体之间遗传差异最主要的表现形式。SNP的研究有助于解释不同群体和个体对疾病,特别是对复杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性和对环境因素反应的表型差异。现有研究表明,具有不同遗传背景的人群,对疾病也存在不同的易感性。芬兰学者Matsson等[10]研究表明S100B基因rs9722 T等位基因与阅读障碍症的发生存在相关性,而我国学者罗秀等[15]报道S100B基因rs9722的遗传变异与阅读障碍症相关性无统计学意义,出现此差异的原因之一可能是两种研究人群的遗传背景不一样。因此,了解S100B 基因多态性及其分布特点,可提供不同地区人群的遗传背景资料,为进一步研究相关疾病在不同地区人群中的发病情况提供遗传信息,同时,对认识 S100B相关疾病的发病机制和防治措施有重要的指导意义。

3.2 S100B基因多态性在广西百色地区人群中的分布及其与不同地区人群的比较

本研究采用单碱基延伸技术和DNA 测序法检测广西百色地区人群S100B基因rs2839356和rs881827位点的多态性,并与Hap Map数据库上公布的4种人群的SNP分型数据比较,结果显示,广西百色地区人群S100B基因rs2839356、rs881827位点在不同性别间基因型和等位基因分布频率差异均无统计学意义,说明两位点多态性与性别无关。与Hap Map上公布的4种不同地区种族人群SNP分型数据比较后表明,广西百色地区人群S100B基因rs2839356、rs881827位点多态性与亲缘关系最近的中国北京汉族人(Hap Map-CHB)比较差异无统计学意义,与亲缘关系相对较远的欧洲人(Hap Map-CEU)、非洲人(Hap Map-YRI)、日本人(Hap Map-JPT)比较差异均有统计学意义。本研究结果符合“亲缘关系越近,其基因型分布越相似,亲缘关系越远,差异越显著”的遗传学规律,同时,也提示S100B基因rs2839356和rs881827位点多态性与其他地区种族人群相比存在差异。基因多态性可能因地理位置、环境、饮食和生活习惯以及种族不同而呈现不同程度的差异[16],而广西是一个多民族聚集的地区,地理环境独特,生活方式与其他地区也存在较大的差异,也可能会导致基因多态性分布的差异,因此,虽然Hap Map-HCB、Hap Map-JPT人群和广西百色地区人群同属于亚洲人群,但这3个不同地区人群的基因型和等位基因分布频率也表现出一定差异。

总之,本研究初步探讨了S100B基因rs2839356和rs881827位点多态性在广西百色地区人群中的分布特征,并分析其与不同地区种族人群的分布差异,为进一步研究群体遗传学和预防相关疾病奠定了重要基础。虽然本研究表明广西百色地区人群S100B基因存在多态性,且与其他地区种族人群相比存在差异,但是,本研究仍存局限性,首先,研究的样本量相对较小。其次,广西是一个多民族聚集的地区,各民族间是否有差异,需要我们进一步研究。而且,本研究所选的人群是医院的体检者,可能存在选择人群的偏倚。因此,如何深入研究S100B基因在不同人群中存在多态性的机制,是本课题组今后努力的方向。