镜下单片状头屑DNA提取分型法与EZ-tape法的比较

白小刚 ，蹇 慧 ，王 惠 ，毛 炯 ，夏 昱 ，冯 涛 ，陈 丹 ，李庆庆 ，朱 镜 ，梁伟波

（1.成都市公安局，四川 成都 610081；2.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041）

头屑由角化程度不同的表皮细胞组成，常见于衣服肩、领部或帽子、头套等内侧，是法医日常检案中能用EZ-tape脱落细胞粘取器获取的一类特殊生物检材。已有文献[1-3]报道可用头屑提取DNA并获得STR分型。EZ-tape脱落细胞粘取器，是公安部物证鉴定中心研制的针对脱落细胞的提取装置，利用胶带直接粘取客体表面的脱落细胞，是现阶段实践中针对接触性检材DNA进行提取的主要方法[4-5]。一般情况下常采用这种方法收集衣帽上的皮屑以达到富集的目的，再提取DNA进行分型，但这种方法检测获得混合分型结果的概率较高[6]，为案件分析带来了一定的困难[7]。如果能对单片状头屑进行DNA提取并STR分型，可提高透明胶带所富集样本的利用率，为案件侦破提供更丰富的证据信息。

本研究采用透明胶带和EZ-tape脱落细胞粘取器粘取收集头屑检材，再分别用镜下单片状头屑DNA提取分型法（简称“单片头屑分析法”）和EZ-tape法提取DNA进行PCR扩增和STR分型，比较两种方法的样本检出情况。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

EZ4体式显微镜、DM2000显微镜加装DFC425 C照相机（日本Leica公司），无菌显微镊［上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂］，EZ-tape脱落细胞粘取器（公安部物证鉴定中心），9700型PCR仪、3130xl基因分析仪（美国AB公司）。

Chelex-100（美国 Sigma公司），蛋白酶 K（美国Roche公司），PowerPlex®21试剂盒（美国 Promega公司）。

1.2 样本采集

两名志愿者轮流佩戴同一顶帽子各10次，每次5min。采用EZ-tape脱落细胞粘取器和透明胶带分别在帽子内侧进行粘取取样。

EZ-tape法：EZ-tape脱落细胞粘取器共粘取24份样本，其中12份在56℃蛋白酶K消化时进行持续振荡，12份样本静置消化。消化时间均为1h。

单片头屑分析法：体式显微镜下观察透明胶带粘取的样本，选取单片状头屑进行取样，其中24份样本在56℃蛋白酶K消化时进行持续振荡，并按头屑直径分为≤200 μm、>200～500 μm、>500 μm 三个亚组，每组8份样本。另在镜下随机选取24片头屑行静置消化处理。消化时间均为1h。

取该两名志愿者的口腔拭子作阳性对照。

本研究符合医学伦理学相关条款规定。

1.3 STR分型

样本均用Chelex-100法提取DNA，EZ-tape法体系内Chelex-100和蛋白酶K分别为65、5μL，单片头屑分析法体系内Chelex-100和蛋白酶K分别为27、3μL。使用 PowerPlex®21试剂盒进行扩增，10μL终体系中包含4μL DNA模板，毛细管电泳获得STR分型。按照PowerPlex®21试剂盒说明书设置扩增及电泳条件。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对不同分组样本获得准确分型的样本数进行Kruskal-Wallis秩和检验。检验水准 α=0.05。

2 结 果

2.1 显微镜观察

取透明胶带放置于显微镜下观察可见：单片状头屑、多片重叠成块状头屑及衣物纤维等散在分布于镜下视野中。同一放大倍数下，三组单片状头屑大小示例见图1。

图1 三组单片状头屑大小示例

2.2 样本分型结果

2.2.1 EZ-tape法分型结果

EZ-tape法所获24份检材分型结果与两份阳性对照比对：11份样本发生漏检，获得了单一来源的分型结果（45.8%），10份获得混合分型结果（41.7%），2份样本未检出（8.3%），1份样本仅3个基因座检出等位基因（4.2%），详见表1。11份获得单一来源分型结果的样本中，3份与志愿者1分型结果一致，8份与志愿者2一致。10份获得混合分型结果的样本中，4份包含两份阳性对照的全部相应等位基因，2份有部分基因座发生等位基因插入（图2），4份有部分基因座发生等位基因丢失，详见表2。

表1 EZ-tape法获得分型结果 （份）

图2 EZ-tape法获得混合分型且部分等位基因发生等位基因插入

表2 EZ-tape法获得的混合分型结果 （份）

2.2.2 单片头屑分析法分型结果

48份单片状头屑分型图谱与两份阳性对照比对后获得的结果见表3。检测到完整分型的振荡样本数为11份，静置消化的为1份；未检出的振荡样本数为4份，静置消化为11份；发生等位基因插入或丢失的振荡样本数为9份，静置消化的为12份。振荡与静置消化处理后的分型准确数之间差异有统计学意义（P＜0.05），而振荡处理的三个亚组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 单片状头屑分型结果 （份）

48份样本中有36份未能获得完整分型，12份获得了完整分型，其中与志愿者1分型结果相同的为8份，与志愿者2分型结果相同的为4份。48份样本中有20份获得了7个以上基因座分型结果，10份在志愿者1的分型中找到，10份在志愿者2的分型中找到；28份获得少于7个基因座的分型而难以判断样本个体来源。48份样本中有2份获得混合分型结果，1份在Penta E和D21S11基因座上出现超过2个等位基因，另1份在CSF1PO基因座上获得志愿者1、志愿者2的混合分型结果。

3 讨 论

头屑由角化程度不同的表皮细胞组成，是日常检案采集样本时常能获取的一类特殊检材。LORENTE等[1-3]的研究表明：利用头屑提取DNA并获得STR分型具有可行性，作为一种特殊类型的法医物证学检材，头屑具有较高的研究价值。本研究采用直接分析检测显微镜下获取的单片状头屑的方法，同时与常规EZ-tape法进行比较。用透明胶带富集头屑后，借助体式显微镜选取单片状头屑提取DNA，能够提高检材利用率并尽量减少形成混合分型。EZ-tape法检测中有10份（41.7%）获得了混合分型结果，其中6份有部分基因座出现等位基因插入或丢失的情况。与之相比，单片头屑分析法中48份样本的分型结果中：有20份样本获得了7个以上便于判断样本来源的基因座分型，其中1份样本的1个基因座检出两名志愿者的混合分型且无基因座检出超过2个等位基因；28份样本获得少于7个基因座的分型而难以判断样本个体来源，其中1份样本在2个基因座上检出超过2个等位基因。对比可见，单片头屑分析法检出混合分型的比例低于常规EZ-tape法，提示单片头屑分析法更利于获得单个个体来源的STR分型结果。此外，常规EZ-tape法与单片头屑分析法均检见等位基因插入或丢失，而发生等位基因插入或丢失的混合分型结果会增加结果分析的难度（图2）。EZ-tape法检测的样本中有11份（45.8%）发生漏检，仅获得单一来源分型结果。1份样本用传统EZ-tape方法仅能进行一次DNA提取及STR分型实验，发生DNA来源未完全检出的可能性大，而在实际案件中，DNA检验人员是根据现场勘验人员提供的EZ-tape脱落细胞粘取器获得的样本进行实验分析，得出DNA报告为刑侦人员提供案件线索，未完全检出DNA来源数量可能导致案件侦查方向错误或嫌疑人“漏网”，比较之下，单片头屑分析法虽增加了工作量，却可减少漏检的概率，可为刑侦人员提供更多、更准确的线索。

单片状头屑属于一个个体，理论上仅能检出单一个体来源的DNA分型，本研究中单片状头屑仍检出混合分型，推测其原因可能在于志愿者在多次轮流戴帽的过程中游离DNA附着在头屑表面。后续研究可对头屑表面是否存留游离DNA及其对分型结果的影响进行深入探讨。

头屑仅含微量有核细胞，可提供的DNA量十分有限。而低拷贝模板样本分型结果最主要的缺陷是在扩增过程中发生随机变异，易产生随机污染[8]，因此，如何有效地从样本中获得更多的DNA以提高DNA提取效率，对提高分型成功率十分关键。本研究尝试探索了蛋白酶K消化过程中样本振荡情况与DNA提取效率之间的关系。在单片头屑分析法中，振荡获得的11个样本的完整分型而静置消化仅获得1个样本的完整分型，二者在分型准确率上的差异有统计学意义。可以看出在DNA提取过程中是否振荡会影响最终的分型结果。推测在蛋白酶K消化过程中对样本进行振荡能更加充分地消化未完全角化的有核细胞，从而释放更多的DNA，最终提高STR分型准确率。

单片头屑分析法中振荡的3个亚组之间，获得准确分型的基因座数量差异无统计学意义，因此，未观察到头屑大小对STR分型准确率存在明显影响，提示头屑大小与其包含未角化有核细胞的数目之间可能不存在线性关系，具体还需要扩大样本量后进行研究。

本研究结果提示，直接分析检测显微镜获取的单片状头屑在降低混合样本检出率和提高个体检出率方面有一定的优势。在采用Chelex-100法提取DNA时，蛋白酶K消化过程中对样本进行振荡可提高分型准确率。而头屑大小与其含有的DNA量是否呈线性关系及其与STR分型成功率的关系还需在今后的研究中进一步探索。