HPLC法测定麝香接骨丸中羟基红花黄色素A的含量

戴作波，姜志戎

江苏省宝应县中医医院药剂科，江苏宝应， 225800

麝香接骨丸是该院自行研制的纯中药制剂，由红花、血竭、麝香、丁香、骨碎补、自然铜、当归、杜仲等十五味中药组成。有和营活血接骨续筋功效。用于跌打损伤所致软组织损伤、骨折脱位中后期筋肉挛痛见上述症候者。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters Alliance e2695型高效液相色谱仪，Waters 2998型PDA检测器（美国Waters公司）。METTLER TOLEDO MS-105DU型电子分析天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）。KH-500DB型数控超声波清洗器 （昆山禾创超声仪器有限公司）。Milli-Q DIRECT8型纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

麝香接骨丸（批号：170612，170626，170701，由本院提供），羟基红花黄色素A对照品（批号：111637-201609，纯度91.9%，购自于中国食品药品研究检定院）。甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司），磷酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Extend C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.7%磷酸溶液（30：70）；流速：1.0 mL/min；检测波长：403 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2 提取条件的考察

该方中红花为饮片粉末入药，因此在考察提取条件时参考2015年版《中国药典》“红花”项下的有关内容：取本品粉末（过三号筛）约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率 300 W，频率 50 kHz）40 min[1]，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

据此考察了甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇和水为提取溶剂，30 min、40 min、50 min 和 60 min 为提取时间[2]，对制剂中羟基红花黄色素A提取得率的影响。

表1 提取条件考察

由此可知，以25%甲醇为提取溶剂，超声处理40 min，效果较好，见表 1。

2.3 线性关系考察

精密称取羟基红花黄色素A对照品2.782 mg，置10 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取对照品贮备液4 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得6#对照品溶液；精密量取对照品贮备液2 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得5#对照品溶液；精密量取对照品贮备液1 mL，置10 mL量瓶中[3]，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得4#对照品溶液；精密量取对照品贮备液0.5 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得3#对照品溶液；精密量取3#对照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀[4]，即得2#对照品溶液；精密量取2#对照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得1#对照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积。每份溶液平行进样2次，求平均峰面积。以平均峰面积为纵坐标（Y），对照品溶液浓度（μg/mL）为横坐标（X），进行线性回归[5]。

表2 标准曲线

羟基红花黄色素A的回归方程为Y=259 81 X-205 03（r=0.999 7），线性范围为 3.20～102.27 μg/mL，见表2。

2.4 定量限与检测限试验

以S/N≈10为标准，羟基红花黄色素A的定量限为 1.60 μg/mL；以 S/N≈2～3 为标准，羟基红花黄色素A的检测限为0.40 μg/mL。

2.5 重复性试验

取批号为170626的本品6份，研细，每份取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）40 min，放冷，再称定重量[6]，用 25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积。每份溶液平行进样2次，求平均峰面积。以平均峰面积照标准对照法计算含量[7]。

见表3表4。

表3 标准对照

表4 重复性试验

2.6 精密度试验

取“重复性试验”中第1份供试品溶液为研究对象。精密吸取该溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积。连续进样6次，计算平均峰面积和RSD，见表5。

表5 精密度试验

2.7 稳定性试验

取“重复性试验”中第1份供试品溶液为研究对象。精密吸取该溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积。间隔若干时间进样1次，计算平均峰面积和RSD，见表6。

表6 稳定性试验

2.8 回收率试验

取批号为170 626的该品6份，研细，每份取约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入羟基红花黄色素 A 对照品溶液（265.59 μg/mL）1 μL 和 25%甲醇 24 μL，密塞，称定重量[8]，超声处理（功率 250 W，频率50 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积。每份溶液平行进样2次，求平均峰面积。以平均峰面积照标准对照法计算[9-10]，见表7、表8。

表7 标准对照

表8 回收率试验

2.9 含量测定

取批号为 170 626、170 612、170 701 的本品，每批3份，研细，每份取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率 250 W，频率 50 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积。每份溶液平行进样2次，求平均峰面积。以平均峰面积照标准对照法计算含量。批号为170 626的样品采用“重复性试验”前3份数据见表9、表10。

表9 标准对照

表10 含量测定

2.10 中间精密度

由该实验室另一名操作人员B，使用Kromasil C18 色谱柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）， 以批号为170626的样品为研究对象，取3份，研细，每份取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率 50 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用 25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积。每份溶液平行进样3次，求平均峰面积。以平均峰面积照标准对照法计算含量，并与“重复性试验”前3份数据比较，见表11、表12。

表11 标准对照

表12 中间精密度

2.11 含量限度

批号为170 612、170 626、170 701的该品三批制剂中，羟基红花黄色素A的平均含量分别为1.102 mg/g、1.070 mg/g、1.045 mg/g，三批的平均含量为 1.072 mg/g。考虑到原料药材产地、种植习惯、采收加工方法的差异和炮制方法的差异等因素拟以“平均含量×80%”为含量限度，即不低于0.85 mg/g。见图1。

图1 含量限度

3 讨论

3.1 耐用性试验

该试验的色谱条件参考2015年版 《中国药典》“红花”项下相关内容。为配制方便，将流动相从“甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液 （26：2：72）” 改为 “甲醇-0.7%磷酸溶液（30：70）”。在此基础上，采用供试品溶液进行了耐用性试验，考察了色谱柱温度 （28℃、32℃）、流速（1.05 mL/min、0.95 mL/min）、波长（401 nm、405 nm）、流动相组成比例（32：68、28：72）、进样量（9 μl、11 μl）对色谱分离的影响。结果发现，上述条件的微小变动，对该试验中羟基红花黄色素A的测定未造成影响。

3.2 空白试验

为考察该方中其它中药饮片对红花中羟基红花黄色素A的测定是否存在干扰，该试验将红花从处方中除去，其余饮片仍按照【处方】组成比例和制剂工艺制成缺红花的空白制剂，并按照【含量测定】方法制成供试品溶液，依法测定分析。结果发现，该方中除红花外的其它饮片，对制剂中羟基红花黄色素A的测定无干扰。

4 讨论

采用高效液相色谱法测定主药红花中有效成份羟基红花黄色素A的含量，准确、简便，阴性无干扰，可作为本制剂的质量标准控制。HPLC法对红花中的活性成份羟基红花黄色素A进行测定。结果表明，该方法简便、准确、重现性好，可作为本制剂的质量标准控制。