骨髓间充质干细胞逆转支气管哮喘小鼠气道重构及其机制

任冬花 关 巍 冯喜英 李西玲 赵 立

(西宁市第二人民医院呼吸科，青海 西宁 810003)

支气管哮喘的发生及不断发展与大量的细胞参与密不可分。这些细胞包括淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、调节性T细胞及气道上皮细胞等同时这些细胞分泌的大量细胞因子也都参与了这一过程。近来研究发现骨髓间充质干细胞(BMSCs)的移植可以有效改善过敏性气道炎症〔1～4〕。究其原理发现，首先BMSCs的多向分化能力，移植的BMSCs在生理刺激下快速分化形成气管类细胞〔5〕，同时还有免疫调节作用〔6～8〕，BMSCs可以调节CD4+CD25+Treg的比例，从而改善气道炎症，具有治疗支气管哮喘的临床前景。同时BMSCs不易被机体的免疫细胞所识别，可以有效逃脱免疫系统的攻击排斥反应，从而达到治疗目的。本研究探讨BMSCs逆转支气管哮喘小鼠气道重构的作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料 胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，SPF级8周龄雄性SD大鼠27只，体重(200±10)g(青海大学医学部动物实验中心)，CKX31型倒置显微镜(日本 Olympus 公司)，DMEM、胰酶、EDTA(Gibco公司，美国)，TaqMix(东盛生物公司)，培养基(美国Gibco公司)，10 cm2培养皿、96孔板(美国 Corning 公司)，倒置相差显微镜(Olympus，日本)，超净工作台SCW-HS-840型 (苏州市长春电子仪器厂)，培养箱(Queue systems TM2711美国)，深低温冰箱(SANYO，AltraLow日本)，全能型高性能台式冷冻离心机(Heaeus，BiofugeStratos德国)，蒸汽高压消毒箱(Tuttnauer，2540MK美国)，细胞计数板 (SCW-HZ型上海医疗设备厂)，卵清蛋白 (OVA，Sigma公司)，Al(OH)3凝胶 (Sigma公司)，流式细胞仪，Anti-CD25-PE (美国BD公司)，Anti-CD45-FITC(美国 BD公司)。

1.2BMSCs的培养 采用SPF级SD大鼠，用水合氯醛麻醉，在严格无菌条件下分离出大鼠股骨，用DMEM冲洗骨髓腔后，采用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次后用DMEM混悬细胞，加入淋巴分离液，分离得到淋巴细胞，37℃、5%CO2条件下培养，稳定传代。

1.3实验动物分组及给药 实验分为哮喘组(10只)，治疗组(10只)，空白对照组(10只)。哮喘组和治疗组分别在1 d、8 d使用OVA腹腔注射致敏，第15、16、17天使用OVA气道内滴入激发哮喘。空白对照组在第14天激发后腹腔注射2 ml含1×107个BMSCs的培养液。空白对照组全部采用等量PBS处理。

1.4支气管肺泡灌洗液提取及检测 造模完成后48 h，采用0.3%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠后，将大鼠气管切开，插管，生理盐水0.5 ml/次，重复灌洗2次。将取得的支气管肺泡灌洗液，1 500 r/min离心10 min，PBS清洗2次，然后将细胞沉淀用100 ml PBS重悬，取10 μl用于细胞总数计数，光学显微镜进行细胞分类，计数200个细胞，计算嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞各占的百分比。

1.5取血进行酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 对大鼠经眼眶摘眼球采血，滴入肝素抗凝管内，3 000 r/min离心20 min，将血清装移至另外干净的1.5 ml EP管中，-20℃保存，待测血清白细胞介素(IL)-4及干扰素(IFN)-γ含量。

1.6取血进行流式检测 对大鼠经眼眶摘眼球采血，滴入肝素抗凝管内，取 50 μl 血标本，加入 5 μl鼠抗CD4-PE、5 μl鼠抗CD25-FITC，混匀，避光孵育20 min，加入红细胞裂解液1 ml，混匀，避光孵育10 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，再用 PBS 2 ml洗1遍，弃上清，加入 200 μl PBS，用流式细胞仪(BD 公司)检CD4+CD25+Treg。

1.7病理切片检测 采集血液及肺泡灌洗液后将各组大鼠处死取出肺组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋后进行切片，进行HE染色，观察病理学改变。

1.8统计学方法 采用SPSS18.0软件进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1BMSCs的分离及纯化 将淋巴分离液分离到的骨髓细胞接种于培养瓶中，在 24 h后可见细胞贴壁，72 h后洗涤细胞除去未贴壁的细胞，7 d左右形成数十个细胞集落，细胞快速增长，培养2 w后细胞长满70%～80%，进行细胞传代。在光学纤维镜下观察细胞均成梭形细胞集落，见图1。

图1 BMSCs培养48 h的形态(×200)

2.2肺泡灌洗液细胞计数情况 小鼠构建支气管哮喘模型成功后肺部出现炎症反应，在肺泡灌洗液细胞计数上的主要表现为，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的比例都显著升高，与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 各组肺泡灌洗液细胞分类计数

与空白对照组比较：1)P<0.01，下表同

2.3各组IL-4、IFN-γ的水平 哮喘组和治疗组IL-4水平较空白对照组明显升高，IFN-γ水平较空白对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 各组血清IL-4和IFN-γ水平比较

2.4各组外周血CD4+CD25+Treg的表达情况 哮喘组CD4+CD25+Treg的比例〔(3.10±1.23)%〕较空白对照组显著减少〔(5.62±0.45)%,P<0.01〕，治疗组CD4+CD25+Treg比例〔(5.12±3.45)%〕较哮喘组显著增高，但显著低于空白对照组(P<0.05)。

2.5肺组织HE染色结果 与空白对照组相比，哮喘组与治疗组可以看到显著的炎症细胞如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的浸润，同时在血管和支气管附近也有炎症细胞的迁移，同时血管附近还有水肿的现象。在小气道则出现上皮细胞的破坏及上皮层的增生，还有部分地方可以见到有黏液栓出现，见图2。

图2 各组肺组织HE切片结果(×200)

3 讨 论

研究发现支气管哮喘发生时气道会出现一系列的变化，主要表现为大量炎症细胞的浸润包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等，这些细胞的活化和增殖能够导致多种细胞因子、毒性蛋白及其他脂类等物质的释放〔9～12〕。这些物质可以直接或间接损伤气道结构，使气管上皮黏膜大量脱落同时还有部分出现黏液栓塞〔13，14〕。 目前支气管哮喘发病机制的研究发现，支气管哮喘的发生和发展不仅和气道的局部环境有关而且还有全身免疫器官和免疫细胞的参与。特别是Th1/Th2的平衡失调情况，出现Th2活化而Th1数量减少，这是支气管哮喘发生的重要原因之一〔15～20〕。而IFN-γ和IL-4作为Th1/Th2细胞的代表因子，也被公认为能够调节哮喘的发生和发展过程。支气管哮喘时，IL-4不断增加，增加的IL-4可以刺激Th0细胞不断向Th2分化，从而诱导B细胞的增殖、分化及活化〔21，22〕。同时还可以刺激B细胞分泌IgE因子，增加内皮细胞分泌T细胞和嗜酸性粒细胞的能力。在Th2不断增殖时则会抑制Th1的产生，从而导致IFN-γ分泌减少〔23～25〕。本研究发现，哮喘组和治疗组IL-4明显增加，同时IFN-γ显著减少，进一步验证了在支气管哮喘过程中Th1/Th2比例出现了失衡。

研究发现，支气管哮喘的发生同时伴随外周的免疫缺陷的机制的发生〔11，26～29〕，CD4+CD25+Treg是调节细胞，可以调节自身免疫耐受的机制。因此支气管哮喘的发生同时会影响CD4+CD25+Treg细胞的比例，近期研究发现通过检测治疗后支气管哮喘患者发现治疗后患者CD4+CD25+Treg比例明显升高。

MSCs是一类来源于骨髓中胚层的非造血干细胞，其具有多种的分化潜能，是目前广泛应用的生物工程种子细胞〔7，30，31〕。BMSCs作为种子细胞的优势主要为：①BMSCs具有不断分化及增殖的能力，因此BMSCs可以用于治疗和损伤的修复工作；②免疫耐受性，BMSCs具有逃避免疫细胞和免疫器官损伤的特性因此采用BMSCs进行移植治疗可以避免其他移植的排斥反应从而应用于身体各个部位的损伤治疗；③免疫调节性能，研究发现BMSCs具有调节CD4+CD25+Treg的功能，通过调节CD4+CD25+Treg的比例，同时减少炎症细胞和炎症因子的数量〔32，33〕;④易分离且易培养，BMSCs可以从股骨中分离出来，且体外培养条件比较成熟使其在分离和培养的过程都比较容易实现。BMSCs 主要是通过调节肺气道损伤的微环境来进一步治疗支气管哮喘，同时BMSCs还可以有效防止支气管哮喘后期肺部的纤维化和胶原聚集的现象〔34，35〕。

综上所述，BMSCs可以移植后可以有效迁移到肺损伤部位，同时通过调节免疫微环境可以达到逆转支气管哮喘小鼠气道重构的目的，其治疗机制可能与CD4+CD25+Treg及细胞因子等有关。但BMSCs治疗效果与淋巴细胞的具体反应机制还需后续研究。