电针联合癌痛贴对骨癌痛大鼠脊髓背角TLR9及TLR9 mRNA的影响

关江锋 王 兵 王 珊 胡作为 杨 航

(武汉市第一医院肿瘤科，湖北 武汉 430022)

骨癌痛(BCP)是大部分恶性肿瘤伴随的症状，还可引发严重的心理疾患，不利于患者预后〔1,2〕。电针联合癌痛贴用于缓解恶性肿瘤BCP疼痛临床效果明显，但其镇痛机制尚不明确。Toll样受体(TLR)9属于Ⅰ型跨膜受体蛋白，在先天性免疫和获得性免疫之间发挥桥梁作用，研究显示TLR9参与了BCP的发生与持续〔3,4〕。本课题拟考察电针联用癌痛贴用于大鼠BCP的可能机制。

1 资料与方法

1.1受试大鼠和Walker256大鼠乳腺癌细胞 雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重200～220 g)共80只，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2002-2003，所有大鼠自由饮水摄食。Walker256大鼠乳腺癌细胞购自武汉生物医学工程研究所。

1.2BCP大鼠的制备 采用水合氯醛腹腔注射麻醉，固定在操作台，剃净左侧后肢的毛，消毒胫骨，切开胫骨上段，暴露胫骨骨面，用牙钻在胫骨打孔，用微量注射器向胫骨骨髓腔缓慢注射10 ml含有3×103Walker256传代大鼠腹水瘤的细胞悬液，注射后用骨蜡封闭钻孔处，医用酒精冲洗，缝合伤口，青霉素涂抹伤口防感染。

1.3分组和给药 将大鼠随机分为对照组(健康大鼠)、模型组、镇痛贴组和电针联合镇痛贴组，每组20只。镇痛贴组：实验前，在大鼠背部对称两侧脱毛，面积为3 cm×3 cm，在各大鼠一侧皮肤敷贴癌痛贴，12 h后去除贴剂，连续给药12 d，癌痛贴主要由蟾酥、生川乌、蚤休、莪术、细辛、乳香和没药配伍制得，由武汉市中西医结合医院制剂室碾成粉末，以一定比例加入基质制成药膏。镇痛贴组和电针联合镇痛贴组：处理同镇痛贴组，同期给予电针治疗，在安静环境下，将大鼠躯干固定在自制固定器上，头部与四肢均可自由活动，将针灸针刺入大鼠左侧“足三里”(ST36)与“昆仑”(BL60)穴，通过韩氏神经刺激仪给予“疏密波”，频率2/100 Hz，强度以引起大鼠后肢肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜，隔日给予电针治疗，每次30 min，连续给药12 d，模型组针灸刺入大鼠学位后，不通电。

1.4机械性痛觉超敏测定 分别在给药前、给药中和给药结束测定大鼠机械性痛觉超敏。在安静环境中，大鼠适应20 min，用一系列规格的Von Frey 细丝(0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g)按一定顺序刺激刺激大鼠左侧足中部，观察并记录大鼠缩足反应，每根细丝的刺激时间为1～2 s，前后两次不同刺激间隔10 min，计算出50%的Von Frey反应阈值，作为机械性痛阈值。

1.5大鼠后肢抓力测定 分别在给药第0、6、12天、采用平衡式测痛仪(中国医学科学研究院生物医学工程研究所，天津)测定大鼠机械性痛觉超敏。将大鼠放置于特质的有机玻璃格子内，前肢趴在格子的斜面上，双侧后肢分别踏在两个独立的传感器上，待大鼠安静后开始检测，检测左右侧后肢负重差值在10 s的计分，每只大鼠连续检测5次，取均值。

1.6脊髓背角TLR9表达 大鼠在10%水合氯醛下麻醉，暴露心脏，经左心室插管，灌入适量生理盐水，冲洗干净血液，灌入4%多聚甲醛250 ml，固定后，取脊髓腰膨大节段，置于4%多聚甲醛中固定2 h，再分别置于10%、20%和30%蔗糖溶液中，梯度脱水至组织沉淀，OCT包埋，冠状冰冻切片。

1.6.1RT-PCR检测脊髓背角TLR9 mRNA水平 大鼠断头，立即在冰浴中取脊髓，将脊髓置于1.5 ml EP管中，每50 mg组织中加入1 ml Trizol试剂，冰浴下匀浆。每1 ml Trizol试剂加入0.2 ml氯仿，震荡15 s，水浴5 min，12 000 r/min，4℃离心15 min，取上层水相置于另一个EP管，加入等体积异丙醇，冰浴15 min，12 000 r/min，4℃离心15 min，弃上清，加入75%乙醇洗涤，7 500 r/min，4℃离心15 min，弃上清，倾去乙醇，空气干燥，将干燥后沉淀置于DEPC水中，在紫外分光光度计下检测OD260和OD280，评估RNA的纯度。以β-actin为内参，TLR9上游引物：5′-TTTCCGGCTAGGGAATGGTTCCC -3′，下游引物：5′- TTAAACCAATGAAAGGTAAT 3′，β-actin上游引物：5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′，下游引物：5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAC-3′。逆转录在0.2 ml无RNase的PCR管内依次加入：70℃变性5 min，冰浴5 min，37℃水浴60 min，95℃水浴5 min，冰浴5 min，得到cDNA。PCR扩增反应体系：94℃ 5 min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 10 min 35个循环。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶影像分析仪成像，分析条带的吸光度，比较各组条带与对照组条带的灰度比。

1.6.2Western印迹检测脊髓背角TLR9水平 大鼠处死后，取胫骨，加裂解液，冰浴匀浆，离心取上清液，取至新的EP管中，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白含量测定。将大鼠脊柱骨用液氮研磨后加入RIPA置于冰上裂解，并将裂解后的蛋白样品转移至100℃水浴加热5 min使蛋白变性。Bio-Rad DC Protein Assay Kit蛋白定量，统一总蛋白上样量为40 μg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)蛋白电泳后，转膜，分别加入Anti-TLR9和β-actin 一抗(兔抗鼠)按说明书1∶1 000稀释，4℃过夜。加入二抗(1∶5 000稀释)，电压15 V，60 min膜的封闭：5%脱脂奶粉/PBST 20 ml，水平摇床，室温封闭2 h。加ECL-plus发光显示液体，曝光，电泳条带经Image J软件处理，分析各组条带与对照组条带面积。

1.7肿瘤局部组织的炎症因子含量检测 剥离大鼠右后肢，钻孔取肿瘤组织，以每100 mg加预冷的500 μl Aim Plex Tissue Lysis缓冲液，匀浆，低温离心留上清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α。

1.8统计学方法 使用SPSS19.0软件进行t检验、χ2检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组大鼠不同时间痛阈值及后肢抓力比较 与对照组比较，给药6、12 d后其余各组机械性痛阈值及后肢抓力均明显降低(P<0.05)，与模型组比较，镇痛贴组和电针联合镇痛贴组均明显增高(P<0.05)，与镇痛贴组比较，电针联合镇痛贴组均明显增高(P<0.05)，见表1。

表1 各组不同时间痛阈值及后肢抓力比较

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与镇痛贴组比较：3)P<0.05；下表同

2.2各组大鼠治疗后脊髓背角TLR9 mRNA和TLR水平比较 与对照组(0.7±0.2，0.4±0.1)比较，模型组TLR9 mRNA和TLR水平(1.3±0.3，1.5±0.5)明显增高(P=0.000)，与模型组比较，镇痛贴组(0.7±0.3，0.7±0.2)和电针联合镇痛贴组(0.4±0.2，0.3±0.1)均明显降低(P<0.05)，与镇痛贴组比较，电镇联合镇痛贴组均明显降低(P<0.05)，见图1。

A～D：对照组、模型组、镇痛贴组、电针联合镇痛贴组图1 各组治疗后脊髓背角TLR9 mRNA和TLR比较

2.3各组大鼠治疗后肿瘤局部组织炎症因子比较 与对照组比较，其余各组IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明显增高(P<0.05)，与模型组比较，镇痛贴组和电针联合镇痛贴组均明显降低(P<0.05)，与镇痛贴组比较，电针联合镇痛贴组均明显降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组治疗后肿瘤局部组织炎症因子比较

3 讨 论

BCP对应中医“骨疽”或“骨蚀”的范畴，中医认为疼痛的发病机制在于体内气血淤阻，经络不通，不通则痛。治疗BCP在于活血化瘀和行气止痛〔5,6〕。癌痛贴方中蟾酥蟾蜍表皮腺体的分泌物，具有攻毒、解毒和止痛的功效；川乌为毛莨科植物乌头的干燥母根，可祛风除湿，温经散寒、祛瘀止痛；蚤休具有消诸疮，除无名肿毒及消肿止血的功效；细辛祛风散寒，通窍止痛的功效；莪术可行气破血消积止痛，乳香与没药相须为用，共奏活血止痛和消肿生肌的功效。诸药联用具有温经散寒通络和解毒活血化瘀的功效，多年来用于治疗和缓解各种恶性肿瘤相关的癌痛均有明显效果〔7～10〕。本课题结果提示癌痛贴有助于改善BCP症状。

TLRs属于高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，在先天性免疫与获得性免疫间发挥作用，近年来研究发现TLRs参与识别内源性组织损伤相关分子模式，在关节炎及脑脊髓炎缺血/再关注等无菌性炎症的发生发展发挥作用〔11〕。TLR9是TLRs家族中的一员，可识别内源性自身DNA中低甲基化和细菌/病毒DNA中未甲基化的CpG序列，TLR9不仅在免疫细胞中表达，也在中枢神经系统表达，尤其在小胶质及星形胶质细胞表达，被激活的TLR9可刺激炎性成分细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子大量表达，引起促炎因子“瀑布”反应，引发疼痛〔12，13〕，另外TLR9的配体能够增加TRPV1调节的钙离子(Ca2+)内流，间接发挥疼痛调节作用。TLR9敲击的自身免疫性脑脊髓炎小鼠浸润的炎性细胞和脱髓鞘病灶均弱于野生型小鼠，进一步提示TLR9可能参与了疼痛的产生〔14〕。本课题结果显示，TLR9参与了BCP疼痛的发生与持续。癌痛贴可显著降低BCP大鼠脊髓背角TLR9及TLR9 mRNA表达，与骨癌帖的组成及有效成分密切相关，如蟾酥所含的有效成分华蟾毒精能够影响TLRs信号传导通路中多种基因的表达，降低TLR9等多种模式识别受体相关基因的表达，促进NFKBIA等NF-κB抑制蛋白的相关基因表达，控制过度炎症反应〔15〕；含有川乌的舒筋蠲痹汤可通过抑制类风湿关节炎大鼠血清及病变局部的TLR9表达〔16〕；莪术所含的异龙脑和姜黄素可抑制HaCaT细胞分泌的TLR9和TLR2表达〔17〕。

中医认为疼痛缘起于风、寒、暑、湿、燥、火或痰湿瘀血等外邪阻滞经络，导致经络不通，加上“风、寒、湿三气杂至合而为痹”，因而不通则痛。BCP所致的疼痛也属于经络不通所致的不通则痛范畴，电针可调和气血，疏通活络，活血止痛，电针对炎症痛或神经痛等多种急慢性疼痛均有较好的镇痛作用。本课题选择“足三里”(ST36)与“昆仑”(BL60)进行电针，有助于后肢病理性疼痛，临床研究显示患者接受电针时，当发生“得气”时才发挥作用，即“行针者，贵在得神取气”，而采用电针治疗，与传统的“捻转提插”的针法类似，使得针刺部位“得气”〔18,19〕。

综上，与单纯使用癌痛贴比，癌痛贴联用电针用于大鼠BCP的镇痛作用明显，镇痛的可能机制与降低脊髓背角TLR9及TLR9 mRNA表达相关。