蒙药萨丽嘎日迪对糖尿病伴蛋白尿大鼠肾组织VEGF和血清TGF-β1的调节作用

娜日苏 韩志强 安 达 巴图德力根

(内蒙古民族大学附属医院蒙医临床药理研究所，内蒙古 通辽 028000)

糖尿病伴肾损害是糖尿病最严重最常见的微血管并发症之一，不加控制会发展为糖尿病肾病(DN)，是糖尿病患者致死的主要原因之一〔1〕。糖尿病伴肾损害属于蒙医“希京病”范畴，蒙医学认为该病是由于三根七素之平衡失调而巴达干偏盛并与赫依交博，导致肝肾燥热而功能衰退，精华与糟粕分解失常所致的一种迁延难愈的病症〔2〕。蒙药萨丽嘎日迪源自蒙医经典著作《至高要方》，具有清肾热，消“黏”，固精功能，主要用于肾寒肾热诸症，腰膝疼痛，梦遗滑精，睾丸肿大〔3〕。研究显示，血管内皮生长因子(VEGF)与DN早期肾小球的病理变化、血管内皮功能病变相关〔4〕。本课题采用链脲佐菌素(STZ)所致大鼠糖尿病模型，研究蒙药萨丽嘎日迪对糖尿病伴蛋白尿大鼠肾组织修复作用及对肾组织VEGF表达和血清转化生长因子(TGF)-β1的调节作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及用药 Wistar大鼠，封闭群，SPF级，170～190 g，雄性，70只，购自长春市亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(吉)-2011-0004。萨丽嘎日迪：由藏红花，诃子，制草乌，木香，白豆蔻，石菖蒲，大蜀季，刀豆，牛胆粉等17种药材组成，购自内蒙古民族大学附属医院制剂室(批准文号：哲卫准字9804-33)。

1.2主要试剂及仪器 STZ(规格：100 mg，北京拜尔迪生物公司，纯度≥98%，-20℃保存)，大鼠微量白蛋白(mALB)、TGF-β1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海沪尚生物有限公司，批号：201501)，超敏电化学发光(ECL)试剂盒(武汉博士德工程有限公司，批号：20150121)。VEGF(Ⅰ抗，Abcam，批号：20150101)，兔多克隆抗体(Ⅰ抗，Abcam，批号：20150302)，PM2235莱卡组织切片机、EG1150H莱卡包埋机(莱卡公司)，MULTISKANMK3全自动多功能酶标仪(芬兰)，WD-9413B凝胶成像系统DYY-6D型电泳仪电源、DYCZ-24DN型迷你垂直电泳仪和DYCP-40D型电转仪(北京六一厂)。

1.3动物模型及分组 将50只Wistar大鼠适应实验室1 w后，禁食不禁水12 h，大鼠腹注1% STZ柠檬酸溶液50 mg/kg，72 h后采尾静脉血，空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖≥〔5〕为造模成功。将造模成功的40只Wistar大鼠按体重分为模型组14只，萨丽嘎日迪低剂量组13只、高剂量组13只。另取20只Wistar正常大鼠，按体重分为空白组10只、空白给药组(空白组+萨丽嘎日迪高剂量组)10只，空白组和模型组灌胃同等体积蒸馏水。萨丽嘎日迪低、高剂量组分别以100 mg·kg-1·d-1和220 mg·kg-1·d-1，每日1次灌胃萨丽嘎日迪。空白组灌胃同等体积的蒸馏水，空白给药组(空白组+萨丽嘎日迪高剂量组)以220 mg·kg-1·d-1每日1次灌胃萨丽嘎日迪，灌胃体积为10 ml/kg，连续灌胃84 d。实验期间大鼠共死亡11只，剩49只，空白组9只，模型组11只，萨丽嘎日迪低、高剂量组分别10只和11只，空白给药组8只。

1.4指标测定 最后一次给药后禁食不禁水12 h，用代谢笼收集24 h尿液，-80℃保存；腹腔注射水合氯醛0.03 ml/kg麻醉，从腹主动脉取血，以3 000 r/min，离心10 min，取血清，-80℃保存，用ELISA检测尿液mALB含量和血清TGF-β1含量；取左侧肾脏，用滤纸吸干肾表面血液，置于10%甲醛溶液固定，脱水脱蜡，包埋，制作4 μm厚石蜡切片，做肾组织HE及PAS染色；取右侧肾脏，-80℃保存，采用Western印迹检测VEGF蛋白的表达。操作步骤：称取右侧肾脏，按总蛋白提取试剂盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒说明书，提取蛋白并定量，SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加抗VEGF单抗(1∶1 000，TBS稀释)或β-actin单抗(1∶500，TBS稀释)，4℃孵育过夜，TBST洗一抗3次，加二抗(1∶2 000，TBS稀释)，TBST洗一抗3次，用超敏ECL化学发光法显影，压X感光胶片，曝光，显影定影，采用X感光胶片用凝胶成像系统对条带进行扫描，分析条带中吸光度值，以目的蛋白VEGF和β-actin内参照吸光度值的比值用于统计分析。

1.5统计方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1各组大鼠24 h尿mALB的比较 与空白组比较，模型组24h尿mALB明显升高，与模型组比较，萨丽嘎日迪各组24 h尿mALB明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2各组血清TGF-β1的比较 与空白组比较，模型组血清TGF-β1明显升高，与模型组比较，萨丽嘎日迪各组血清TGF-β1明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组24 h尿mALB、血清TGF-β1水平比较

与空白组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

2.3各组肾组织病理变化 HE染色结果表明，空白组肾小球大小适中、结构清晰，肾小管及间质未见病理改变；模型组肾小球肥大，肾小球的细胞增生明显，系膜基质增生，系膜区扩大，肾小管上皮细胞可见空泡变性，间质可见水肿；与模型组比较，萨丽嘎日迪各组肾组织肾小球系膜基质增生减少，见图1。PAS 染色结果表明，空白组肾小球、肾小管及间质未见病理改变；模型组肾小球肥大，肾小球基底膜增厚、系膜基质增多，肾小管上皮细胞糖原颗粒变性明显；各治疗组肾小球基底膜、系膜均有不同程度增生，病变情况好于模型组，见图2。

2.4各组大鼠肾组织VEGF蛋白表达的变化 与空白组VEGF蛋白表达(0.84±0.06)比较，模型组VEGF蛋白表达水平明显升高(0.98±0.05)，与模型组比较，萨丽嘎日迪低、高剂量组及空白给药组肾组织VEGF蛋白表达水平明显下降(0.89±0.08、0.92±0.03、0.87±0.07)，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图1 各组大鼠肾脏病理变化(HE，×200)

图2 各组大鼠肾脏病理变化(PAS，×200)

A：空白组；B：模型组；C：萨丽嘎日迪高剂量组；D：萨丽嘎日迪低剂量组；E：空白给药组图3 各组大鼠肾组织VEGF蛋白表达的变化

3 讨 论

DN是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一，也是造成终末期肾病(ESRD)的最常见原因之一，有20%～40%的糖尿病患者最终会发展到DN阶段〔6〕。由于其发病机制不明确，尚缺乏理想的治疗方法。研究表明，早期DN的特征是尿液中白蛋白排泄率轻度增加，逐步进展至大量白蛋白尿上升，最终发生肾衰竭〔7〕。近年研究发现，除高血糖和脂质代谢异常外，尚有免疫机制炎症因子和血管新生等也参与了DN的发病〔1〕。 mALB是常用的肾小球滤过功能早期受损的一个敏感、可靠指标，其可以反映肾小球的早期的轻微损害〔8，9〕。白蛋白分子是一种可以通过肾小球滤过膜的最小蛋白质，通常滤过膜后几乎被近曲小管全部吸收，因此正常机体的尿液中的排泄量微乎其微，但当肾小球发生病变后，肾小球基底膜上的负电荷乙酰硫酸肝素等物质的分泌会减少，破坏了滤过屏障，导致滤过量与肾小管吸收量间的平衡被打破，这样就导致了尿液中的白蛋白排泄量升高。由此说明尿白蛋白的检测是糖尿病患者肾功能损伤的早期诊断指标之一，同时也是反映患者的肾功能损伤程度的重要监测指标〔10〕。mALB可作为目前糖尿病早期肾损伤优选诊断指标〔11〕。本研究表明，萨丽嘎日迪对糖尿病早期肾损伤大鼠24h尿mALB有降低作用，使肾组织肾小球系膜基质增生减少，糖原颗粒聚集少。

TGF-β1是肾小球硬化及肾纤维化共同通路的主要介导因子，在所有的DN患者中均可见TGF-β1活化。TGF-β1可促进肾脏固有细胞肥大，加速ECM分子合成，并还具有促纤维黏连蛋白(FN)、Ⅰ、Ⅳ胶原蛋白表达，促细胞基质(ECM)集聚及纤维化的效用，其表达水平与DN患者肾纤维化程度有关〔12〕。本实验说明萨丽嘎日迪对DN大鼠血清TGF-β1有抑制或降解作用。

VEGF是一种内皮细胞特异性的丝裂原，已发现VEGF与DN的发生发展密切相关。有研究表明，系膜区VEGF表达增加可促进系膜区蛋白外渗，血管外基质增加而导致系膜区体积增大。另外，VEGF也可引起内皮细胞形态改变，通过影响细胞信号转导及细胞间转运来调节蛋白尿的形成〔13〕。给予 VEGF单克隆抗体或血管生成抑制剂可缓解实验性糖尿病鼠肾高滤过、肾脏萎缩、肾重和白蛋白排泄，提示VEGF与DN阶段的血管结构改变，血管新生有关〔12〕。因此，抑制VEGF的过表达对延缓DN的发生、发展和转归有着重要的理论意义和临床价值。本实验表明，糖尿病肾损伤大鼠肾脏组织VEGF的表达明显增多，萨丽嘎日迪可以有效降低DN大鼠肾组织VEGF的异常表达。