一种新型α-甘露糖苷酶的异源表达及酶学性质表征

杨 帆， 李 鹤， 杨 兰， 李 宪 臻

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

黄原胶(xanthan)是一种重要的阴离子杂多糖[1-3]，其分子质量在2×103～2×104ku[4]，由重复的五糖单元组成，其主链是由β-(1，4)-糖苷键相连接而成的纤维二糖，侧链则由β-D-甘露糖-(1，4)-β-D-葡萄糖醛酸-(1，2)-α-D-甘露糖连接[5-7]。这种复杂的分子结构赋予黄原胶其他凝胶不可比拟的特性，是目前国际上集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体，性能较为优越的生物胶，广泛应用于食品、石油和制药行业[8-10]。

研究表明，黄原胶三糖侧链不同程度的截断会赋予黄原胶分子新的理化特性。由侧链截断的黄原胶降解所产生的寡糖不仅具有植物诱抗活性，还能够有效抑制X.campestris的生长，对黑腐病的防治具有多重功效[11-13]。现阶段，黄原胶寡糖主要是由微生物降解黄原胶获得[14-15]。天然菌株降解黄原胶获得的寡糖产物为聚合度分散、侧链结构多样的混合物。加之后续寡糖分离纯化困难[16]，目前黄原胶寡糖的活性研究均以寡糖混合物为对象，因此难以阐明其构效关系。由于黄原胶的生产和应用细化，使得开发能够水解其三糖侧链的酶制剂以获取改性黄原胶具有很好的研究价值。

本实验对一株性能优良的新型黄原胶降解菌株Microbacteriumsp. XT11中α-甘露糖苷酶编码的基因MiMan进行克隆、表达及纯化并进行酶学性质表征。作为一种特异性水解黄原胶侧链的酶，α-甘露糖苷酶通过切割黄原胶侧链和主链之间的糖苷键实现对黄原胶的修饰。以期为工业化应用侧链修饰黄原胶提供有效、可靠的生物酶制剂。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

微杆菌Microbacteriumsp. XT11，大连工业大学微生物资源与生物催化实验室保藏。EscherichiacoliDH5α，大连宝生物有限公司；E.coliBL21(DE3)、质粒pET-28a(+)获赠于大连化学物理研究所赵宗保研究员课题组。PrimeSTAR HS DNA Polymerase、250 bp DNA Marker、1 kb DNA Marker、Protein Marker (High)限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ、基因组提取试剂盒，TaKaRa生物工程(大连)有限公司。

黄原胶发酵培养基：食品级黄原胶3 g/L，酵母浸粉3 g/L，无水葡萄糖0.5 g/L；无机盐溶液：MgSO425 mg/L，NaCl 800 mg/L，K2HPO450 mg/L，KNO3700 mg/L，pH 7.0；LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L；LB固体培养基：琼脂粉15.0 g/L，其余成分同LB液体培养基。

TGL-16高速台式冷冻离心机，湘仪离心机厂；JY92-IIN超声破碎仪，宁波新芝生物技术有限公司；AKTA蛋白质纯化系统，GE Healthcare；UV5200紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计

甘露糖苷酶编码基因MiMan的克隆及表达载体的构建、鉴定所用引物均合成于上海生工生物有限公司。所使用的引物序列及功能如表1所示。

表1 引物序列及功能

1.2.2 甘露糖苷酶编码基因MiMan的克隆

取出摇床培养发酵12 h后的微杆菌Microbacteriumsp. XT 11菌液，4 ℃、6 000 r/min离心去除上清，超纯水清洗菌体2遍。采用基因组提取试剂盒按照标准流程提取XT11基因组DNA，并以之为模板进行甘露糖苷酶编码基因的扩增。反应体系：基因组DNA模板100 ng，上下游引物20 μmol/L，5×Primer STAR Buffer 10 μL，dNTPs 2.5 mmol/L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1.25 U，DMSO(保护剂)5 μL，加无菌水至总体积50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min 10 s，30个循环，72 ℃ 10 min，20 ℃结束反应。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，并采用胶回收试剂盒进行回收。将回收的MiMan基因片段通过TA克隆连接至pMD19-T Simple Vector构建质粒pT-man，并进行测序验证。

1.2.3 pET-MiMan表达载体的构建

以质粒pT-man为模板，利用引入EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的引物man-F2和man-R2进行带有酶切位点的编码基因的扩增。PCR反应体系及反应条件与“1.2.2”相同。将表达载体pET-28a(+)和回收后的PCR产物分别进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，并用回收试剂盒回收，将回收的线性化质粒与目的片段按浓度比3∶1进行T4连接，16 ℃反应2 h，转化至E.coliDH5α热激感受态细胞中，并涂布于30 μg/mL卡那霉素的LB平板上，挑选阳性克隆并提取质粒测序验证，构建正确的表达质粒即为pET-MiMan。

1.2.4 甘露糖苷酶MiMan的表达纯化

将表达质粒pET-MiMan电击转化至BL21(DE3)感受态细胞中，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，正确的转化子BL21(DE3)-MiMan进行目的蛋白表达。

将BL21(DE3)-MiMan种子液按1∶100转接于1 L含30 μg/mL卡那霉素的LB培养基，培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度0.5 μmol/L；16 ℃、200 r/min诱导20 h；70 mL Native Binding Buffer重悬菌体并采用超声破碎细胞。带有6His标签的甘露糖苷酶MiMan利用Ni-NTA填料进行纯化。具体步骤：将Ni Sepharose 6 Fast Flow填料装入直径为1 cm 的纯化柱中，用8倍柱体积超纯水洗涤，4倍柱体积Native Binding Buffer平衡填料，加入浓缩液在室温下充分结合约1 h，分别流加Native Binding Buffer和Native Wash Buffer约8倍柱体积至无蛋白质。缓慢流加Native Elution Buffer，及时收集洗脱蛋白。蛋白质样品均采用SDS-PAGE电泳进行成分分析，并用Bradford法[17]测定蛋白质浓度。

1.2.5 甘露糖苷酶MiMan的酶活测定

100 μL酶液与100 μL 0.4 mmol/L pNP-α-D-Man混匀，40 ℃反应10 min，立即加入400 μL 0.25 mol/L Na2CO3终止反应，测定OD405，以煮沸灭活5 min的酶液作为阴性对照。酶活力单位定义：每分钟释放1 μmol/L pNP所需的酶量为1 U。

1.2.6 甘露糖苷酶MiMan的最适温度及热稳定性测定

酶的最适温度测定实验是分别在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃反应10 min后，立即加入400 μL 0.25 mol/L Na2CO3终止反应，测定OD405。以测定出最高的酶活力为100%，得到该酶的最适温度；酶的温度稳定性实验是将酶液分别在30、40、50、60、70 ℃温育30 min后测定剩余酶活力，以测定出最高的酶活力为100%，得出该酶温度稳定性曲线。

1.2.7 甘露糖苷酶MiMan的最适pH及pH稳定性测定

用缓冲液分别将酶液pH调节为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0，与pNP-α-D-Man于40 ℃反应10 min，立即加入400 μL 0.25 mol/L Na2CO3终止反应，测定各pH下的OD405。以测定最高的酶活力为100%，得到该酶的最适pH；取100 μL酶液+100 μL不同pH的缓冲液，于10 ℃温育20 h，在pH 7.0、40 ℃条件下反应10 min后测定酶活，得到该酶的pH稳定性曲线。

2 结果与讨论

2.1 MiMan基因的PCR扩增和序列分析

以微杆菌Microbacteriumsp. XT 11基因组DNA为模板，经PCR扩增出一条3 000 bp左右的特异性条带，大小与甘露糖苷酶目的基因片段一致，琼脂糖凝胶电泳如图1所示。

1，MiMan基因目的条带；M，DNA marker

将构建好的质粒pT-man送至吉林库美生物测序，经NCBI数据库比对证明为甘露糖苷酶的编码基因，大小为3 042 bp，含有1 014个氨基酸残基，理论分子质量为112.4 ku。N端含有200 aa 的功能未知非催化域，204～1 006 aa为糖苷水解酶GH38家族催化域，如图2所示。

经比对，微杆菌Microbacteriumsp. XT11来源的甘露糖苷酶与Arthrobactersp. Soil736、Microbacteriumtestaceum、Pseudarthrobacterchlorophenolicus、Pseudarthrobacterequi的甘露糖苷酶的同源性分别为57.4%、61.3%、58.0%、58.7%，说明本研究的酶与其他来源的甘露糖苷酶相似度不高，因此很可能属于具有新性能的分支酶类。

2.2 甘露糖苷酶MiMan表达载体及菌株的构建

将经过EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切的表达载体pET-28a(+)与甘露糖苷酶基因片段于16 ℃连接2 h，转化至E.coliDH5α中，并涂布于含有相应抗生素的平板上。从平板上挑取阳性克隆子进行质粒提取，并用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切验证。1%琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，2号质粒经双酶切后(2′)有3.0和5.3 kb大小的两条特异性条带，结果符合预期。将验证正确的重组质粒送吉林库美生物测序，结果表明黄原胶甘露糖苷酶重组质粒pET-MiMan构建成功。将表达质粒pET-MiMan电击转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，涂布于平板后37 ℃静置培养12 h，并挑取阳性克隆进行后续表达工作。

白色区域代表高同源性序列区；波浪线注释区域为GH38家族催化域

1、2，pET-MiMan；1′、2′，pET-MiMan酶切条带；M，DNA Marker

2.3 MiMan基因的异源表达及纯化

将甘露糖苷酶表达菌株BL21(DE3)-pET-MiMan种子液按1∶100转接于含30 μg/mL 卡那霉素的LB培养基，培养至OD600为0.6～0.8后加入终浓度0.5 μmol/L的IPTG，于16 ℃、200 r/min培养20 h。离心弃上清之后进行超声细胞破碎，获得粗酶液。利用Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和填料和DEAE对目的蛋白MiMan进行纯化。SDS-PAGE电泳结果如图4所示，MiMan在大肠杆菌中能够高水平的可溶性表达。经纯化后，杂蛋白被有效去除，获得纯度大于90%的目的蛋白。如表2和图4所示，目的蛋白MiMan分子质量约为110 ku。质量浓度为0.23 mg/mL，回收率为8.96%，相对酶活为0.224 U/mg。

1，粗酶液；2，穿出液；3、4，清洗液； 5、6，洗脱液；M，蛋白marker

表2 重组MiMan蛋白的纯化结果

2.4 甘露糖苷酶MiMan的酶学性质

如图5所示，MiMan在40 ℃时达到最大酶活力，在25～50 ℃保持较高的酶活力。当反应温度为55 ℃时，酶活力迅速下降。热稳定性实验结果可以看出，当温度低于40 ℃时，MiMan能够保持很高的酶活力；而温度高于40 ℃时，酶活力急剧下降，表明MiMan对于高温耐受力较低。

如图6所示，MiMan在pH 7.0时表现出最大酶活力，pH在6.5～9.0保持最大酶活(70%以上)。在pH 6.5～11.0的缓冲液中温育20 h后，残存的酶活力均超过最大酶活的80%。在pH 12.0条件下，酶活在最大酶活的70%以上，说明MiMan具有很好的碱性环境耐受能力。

图5 甘露糖苷酶MiMan的最适温度及热稳定性

图6 甘露糖苷酶MiMan的最适pH及pH稳定性

3 结 论

本实验以一株性能优良的微杆菌Microbacteriumsp. XT11为出发菌株，从基因组DNA中克隆出甘露糖苷酶编码基因MiMan，在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了融合His亲和纯化标签的甘露糖苷酶MiMan，得到了可溶性表达水平较高的酶液，纯化回收率达8.96%。纯化MiMan酶学性质分析结果表明，该酶最适作用温度为40 ℃，最适pH 7.0，对高温的耐受力较低；而酶液在pH 5.0～12.0的缓冲液10 ℃温育20 h后仍能保持较高活力，说明该酶对碱性环境具有一定的耐受力。Microbacteriumsp. XT11菌株是实验室新筛选出的黄原胶降解菌株，因其高效的黄原胶降解能力，为黄原胶降解途径的解析及重建提供了良好的研究模型。本实验对来源于XT11的黄原胶侧链修饰酶——甘露糖苷酶的表达纯化和酶学性质进行了初步研究，为进一步性质表征及酶液制备打下基础。